EXSISERS报告系统的构建与验证
验证内含肽介导的无痕剪接是否不影响天然异构体表达，并建立双荧光素酶比值读出。
将NLuc和FLuc分别插入MAPT外显子10和11， flanked by分裂内含肽和卷曲螺旋，通过CRISPR-Cas9生成稳定细胞系，用免疫印迹和荧光素酶 assay验证剪接效率和异构体比例。
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外显子特异性异构体表达的非侵入性高通量检测
Non-invasive and high-throughput interrogation of exon-specific isoform expression.
实验完整度
高包含HEK293T细胞系、hiPSC来源神经元、小鼠N2a细胞等多层级模型，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞系 hiPSC来源的皮层神经元 smNPCs（小分子诱导的神经前体细胞） 小鼠N2a细胞系
重点核对
EXSISERS报告基因插入MAPT外显子10和11，使用gp41-1和NrdJ-1分裂内含肽及卷曲螺旋结构域，验证无痕剪接。 利用双荧光素酶比值（NLuc/FLuc）定量4R-tau与pan-tau的比例，并通过免疫印迹和RT-qPCR验证。 在hiPSC来源的神经元中监测tau异构体表达随分化时间的变化。 通过CRISPR-Cas9筛选鉴定FOXP1外显子18b的调控因子，验证MBNL1和MOV10的作用。 使用ITU处理HEK293T和smNPCs，验证外显子10包含的剂量依赖性变化。
摘要
来自可变剪接mRNA的外显子特异性异构体表达是一种基本机制，可显著扩展细胞的蛋白质组。然而，评估可变剪接的传统方法要么是消耗性的且工作量大，要么不能在蛋白质水平上纵向定量异构体表达。因此，我们开发了一种外显子特异性异构体表达报告系统（EXSISERS），该系统通过高效的、内含肽介导的蛋白质剪接，从新生多肽链上无痕切除报告蛋白，从而非侵入性地报告内源基因中含外显子异构体的翻译。我们应用EXSISERS定量了患者来源诱导多能干细胞中微管相关蛋白tau（MAPT）疾病相关外显子10的包含情况，并筛选了基于Cas13的RNA靶向效应器以评估异构体特异性。我们还将细胞存活与FOXP1外显子18b的包含联系起来，该外显子参与维持胚胎干细胞的多能性，并确认MBNL1是外显子18b排斥的主要因素。EXSISERS能够以高灵敏度和细胞分辨率对国际外显子特异性异构体表达进行非破坏性、多模式监测，并支持外显子特异性治疗干预的高通量筛选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种非侵入性、高通量的方法，在蛋白质水平上定量外显子特异性异构体表达，并应用于tau异构体监测和筛选外显子特异性干预措施。
- 核心机制
- EXSISERS通过内含肽介导的蛋白质剪接，将报告蛋白从含外显子的异构体中无痕切除，从而通过荧光素酶信号比值报告外显子包含情况，保留天然异构体比例。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中验证了EXSISERS的无痕剪接和比例读出的准确性；在hiPSC来源的神经元中纵向监测到4R-tau比例随分化增加；通过CRISPR筛选鉴定MBNL1为FOXP1外显子18b的主要抑制因子，MOV10为辅助因子。
- 研究意义
- EXSISERS能够以高灵敏度和细胞分辨率非破坏性地监测外显子特异性异构体表达，并支持外显子特异性治疗干预的高通量筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
tau异构体比例的药理学调控和纵向监测
验证EXSISERS能否检测小分子对exon 10包含的影响，并进行长期监测。
用DYRK1A/GSK3A抑制剂ITU处理EXSISERS细胞，测量NLuc/FLuc比值变化，并在hiPSC来源的smNPCs和神经元中进行纵向监测。
RNA靶向系统的优化和异构体特异性筛选
优化Cas13效应器的亚细胞定位、spacer长度和靶位点，以实现异构体特异性敲低。
比较RfxCas13d-NLS和PspCas13b-NES对MAPT exon 10的靶向效果，测试不同spacer长度和靶向外显子连接位点的crRNA，并用双荧光素酶和RT-qPCR验证。
基于细胞存活的筛选鉴定剪接调控因子
通过将细胞存活与外显子包含耦合，筛选调控FOXP1外显子18b的因子。
将BSD插入FOXP1外显子18b，进行全基因组CRISPR敲除文库筛选，用杀稻瘟菌素S选择，通过NGS鉴定富集的sgRNA，并验证MBNL1和MOV10的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | Q5热启动高保真2×预混液 | New England Biolabs (NEB) | -- |
| Monarch DNA凝胶提取试剂盒 | NEB | -- | |
| T4 DNA连接酶（快速连接试剂盒） | NEB | -- | |
| NEBuilder HiFi DNA组装预混液（2×） | NEB | -- | |
| 细胞培养 | Advanced DMEM培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Accutase细胞消化液 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| hiPSC培养 | Essential 8 Flex培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| Geltrex基质胶 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| StemMACS传代溶液XF | Miltenyi Biotec | -- | |
| smNPC转化 | SB431542 | Selleck Chemicals | S1067 |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4953 | |
| 嘌呤吗啉 | Cayman Chemicals | 10009634 | |
| 噻唑维文 | Merck Millipore | 420220 | |
| 神经元分化 | FGF8b | Miltenyi Biotec | 130-095-740 |
| LDN193189 | Miltenyi Biotec | 130-103-925 | |
| 脑源性神经营养因子 | Miltenyi Biotec | 130-093-811 | |
| 转染 | X-tremeGENE HP转染试剂 | Roche | -- |
| 双荧光素酶检测 | Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | N1610 |
| Nano-Glo活细胞检测系统 | Promega | -- | |
| Nano-Glo Endurazine活细胞底物 | Promega | -- | |
| VivoGlo D-荧光素 | Promega | -- | |
| 免疫印迹 | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗pan-tau抗体（PC1C6） | Merck Millipore | MAB3420 | |
| 抗3R-tau抗体（8E6/C11） | Merck Millipore | 05-803 | |
| 抗OLLAS抗体（L2） | Thermo Fisher Scientific | MA5-16125 | |
| RT-qPCR | Luna Cell Ready探针一步法RT-qPCR试剂盒 | NEB | -- |
| ACTB TaqMan基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | Hs01060665_g1 | |
| pan-tau TaqMan基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | Hs00902194_m1 | |
| 4R-tau TaqMan基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | Hs00902312_m1 | |
| 细胞成像 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Alexa Fluor 594标记的驴抗山羊IgG | Thermo Fisher Scientific | A11058 | |
| Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | |
| Alexa Fluor 488标记的驴抗山羊IgG | Thermo Fisher Scientific | A11055 | |
| 流式细胞术 | BD FACSaria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 生物发光成像 | LV200生物发光成像系统 | Olympus | -- |
| 生物发光定量 | Centro LB 960酶标仪 | Berthold Technologies | -- |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EXSISERS细胞系构建 | CRISPR-Cas9靶向序列、同源臂长度、供体质粒设计、内含肽和卷曲螺旋组合 阅读提示：Methods: Generation of stable EXSISERS cell lines with CRISPR–Cas9; Supplementary Figs. 1, 2 |
| 双荧光素酶检测 | 底物加入顺序、孵育时间、检测时间点、细胞接种密度 阅读提示：Methods: Bioluminescence quantification; Figure legends for Figs. 1d, 2d,e, 3c, 4b,d, 5b,e |
| ITU处理 | ITU浓度范围、溶剂对照、处理时间 阅读提示：Methods: Small-molecule manipulation of alternative splicing; Figs. 2d,e and 3c legends |
| hiPSC分化 | 分化方案、时间点、smNPC转化方法 阅读提示：Methods: hiPSC maintenance, smNPC conversion and maintenance, hiPSC-derived neurons; Fig. 3a |
| CRISPR筛选 | 文库感染复数、杀稻瘟菌素S浓度、选择时间、NGS引物 阅读提示：Methods: Lentiviral human CRISPR pooled genome-wide KO library; Fig. 6b,c |