检测内源性H2O2的节律性振荡
验证细胞内和肝脏中H2O2水平是否呈昼夜节律
使用HyPerRed荧光探针在N2a和U2OS细胞中连续监测H2O2；用Amplex Red检测N2a细胞和小鼠肝脏H2O2浓度。
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p66Shc维持的内源性H2O2昼夜振荡调控生物钟
Diurnal oscillations of endogenous H2O2 sustained by p66Shc regulate circadian clocks.
实验完整度
高包含体外细胞、小鼠肝脏/SCN、基因敲入/敲除小鼠等多层级模型，并有功能与机制验证
主要模型
N2a小鼠神经母细胞瘤细胞 U2OS人骨肉瘤细胞 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和小鼠成体成纤维细胞(MAFs) p66Shc KO、ClockC195S、Clock KO及mPer2::LUC小鼠
重点核对
H2O2处理浓度（2–200 μM）和时间对CLOCK氧化的影响 CLOCK C195S突变对H2O2敏感性和节律振荡的影响 p66Shc KO对H2O2水平、CLOCK氧化和昼夜周期的影响 血清休克同步化后4小时间隔取样检测节律 小鼠在DD条件下的轮跑活动周期和光脉冲相位移动
摘要
氧化还原平衡是健康生理稳态的基本特征，受生物钟调节，但内源性氧化还原信号是否或如何反向调节哺乳动物生物钟仍不清楚。在此，我们报道了哺乳动物细胞和小鼠肝脏中内源性H2O2水平的昼夜节律。使用无偏倚方法筛选H2O2敏感性转录因子，我们发现内源性H2O2振荡对CLOCK的节律性氧化还原调控是细胞内生物钟正常功能所必需的。重要的是，p66Shc缺失诱导的H2O2水平节律紊乱（p66Shc在小鼠肝脏和SCN中节律性振荡）会干扰CLOCK功能的节律性氧化还原调控，重编程肝脏转录组振荡，延长小鼠的昼夜周期，并调节光诱导的生物钟重置。我们的发现表明，氧化还原信号节律通过CLOCK的可逆氧化修饰与生物钟系统内在耦合，并构成哺乳动物中重要的机制性计时组件。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内源性H2O2的昼夜振荡是否存在，以及它是否通过氧化还原信号反向调控哺乳动物生物钟？
- 核心机制
- p66Shc维持内源性H2O2的节律性振荡，H2O2通过可逆氧化CLOCK的Cys195残基增强CLOCK与BMAL1的相互作用及DNA结合活性，从而调控生物钟功能。
- 主要证据
- 在细胞和肝脏中检测到H2O2和CLOCK氧化状态的节律性振荡；C195S突变消除CLOCK的氧化敏感性并损害节律；p66Shc KO改变H2O2振荡、重编程肝脏转录组、延长小鼠昼夜周期并增强光诱导的相位延迟。
- 研究意义
- 揭示了氧化还原信号节律通过CLOCK氧化修饰与转录翻译反馈环路耦合，构成哺乳动物重要的计时机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选H2O2敏感性转录因子
鉴定受H2O2调控的转录因子
用catTFRE pull-down结合质谱分析小鼠肝脏核提取物中H2O2处理后的转录因子DNA结合活性变化。
验证CLOCK的氧化还原状态振荡
检测CLOCK是否受H2O2氧化修饰并呈节律性
用BIAM标记还原态半胱氨酸，用BTD和DCP-Bio1标记S-亚磺酰化；在细胞和肝脏中检测CLOCK-SH和CLOCK-SOH水平。
确定C195为关键氧化位点
验证C195是否介导CLOCK的氧化还原节律
构建C195S突变体，在细胞中检测CLOCK氧化敏感性；用CRISPR/Cas9构建ClockC195S敲入小鼠，检测肝脏和MAFs中CLOCK氧化节律。
验证C195氧化对CLOCK功能的影响
探究C195氧化是否影响CLOCK与BMAL1的相互作用及转录活性
用纯化蛋白进行非变性PAGE、EMSA和Scatchard分析；在MAFs中检测下游基因表达和节律。
研究p66Shc对H2O2节律和CLOCK功能的调控
验证p66Shc是否维持H2O2振荡并影响CLOCK功能
使用p66Shc KO MEFs和肝脏检测H2O2水平及CLOCK氧化；用mPER2::LUC报告系统检测节律。
评估p66Shc KO对肝脏转录组和代谢的影响
分析H2O2节律紊乱对肝脏转录组振荡和代谢的影响
对WT和p66Shc KO小鼠肝脏进行RNA-seq，检测NAD+/NADH、甘油三酯和β-羟丁酸水平。
验证p66Shc KO对小鼠昼夜行为的影响
确定H2O2节律紊乱是否改变小鼠昼夜节律行为
监测轮跑活动，计算周期长度，并在CT14给予光脉冲检测相位移动。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| H2O2检测 | HyPerRed | Addgene | 48249 |
| Amplex Red | Cell Biolabs | STA-344 | |
| CLOCK氧化检测 | BIAM | Molecular Probes | B1591 |
| DCP-Bio1 | Kerafast | EE0028 | |
| BTD | Kate S. Carroll's lab | -- | |
| H2O2处理 | 过氧化氢溶液 | Sigma | 88597 |
| H2O2降解 | 牛肝过氧化氢酶 | Sigma | C1345-1G |
| p66Shc磷酸化抑制 | LY333531 | Sigma | SML0693 |
| CGP53353 | Sigma | C7866 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 |
| ScreenFect A转染试剂 | InCella | S3001 | |
| VigoFect转染试剂 | Vigorous Biotechnology | T001 | |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | 06366236001 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA His结合树脂 | Novagen | 70666-5 |
| 免疫印迹 | CLOCK抗体 | Cell Signaling Technology | 5175 |
| Shc抗体 | BD bioscience | 610878 | |
| Shc (phospho-S36)抗体 | Abcam | ab54518 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| HRP标记链霉亲和素 | Thermo Scientific | S911 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| H2O2节律检测 | 细胞同步化方法（血清休克）、检测间隔（5分钟或4小时）、小鼠DD条件持续时间（72小时） 阅读提示：Methods中“Fluorescence time-lapse microscopy and data analysis”和“Hydrogen peroxide assay”小节，以及Figure 1图注。 |
| CLOCK氧化检测 | BIAM/DCP-Bio1/BTD浓度、H2O2处理剂量（2–200 μM）、取样时间点 阅读提示：Methods中“Biotinylated IAM/DCP-Bio1 labeling and immunoblotting for cultured cells”小节，以及Figure 2和Extended Data Figure 2图注。 |
| C195S突变实验 | 突变体构建方法、转染效率、H2O2处理浓度（10−6–10−5 mM） 阅读提示：Methods中“Constructs and site-directed mutagenesis”和“Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) assay”小节，以及Figure 3和Figure 4图注。 |
| p66Shc KO实验 | 小鼠年龄（8–10周）、性别、组织取样时间点、LY333531浓度（1 μM） 阅读提示：Methods中“Animals”和“Real-time luciferase assays, drug treatment, and transfection”小节，以及Figure 5图注。 |
| 昼夜行为实验 | 光脉冲强度（400 lux）和持续时间（15分钟）、DD条件下监测天数（20天）、小鼠数量 阅读提示：Methods中“Locomotor activity”小节，以及Figure 7图注。 |