整合基因组分析鉴定BAP1靶基因
鉴定BAP1依赖的H2Aub占据和转录变化，寻找与代谢相关的靶基因。
在UMRC6细胞中稳定表达EV、BAP1 WT或C91A突变体，进行H2Aub ChIP-seq和RNA-seq，整合分析并做GO富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
BAP1将铁死亡的代谢调控与肿瘤抑制联系起来
BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.
实验完整度
高包含细胞系、小鼠模型和癌症基因组数据，并进行功能与机制验证
主要模型
UMRC6肾癌细胞系 NCI-H226间皮瘤细胞系 786-O、Caki1、ACHN肾癌细胞系 Bap1 WT和KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
BAP1 WT或C91A突变体在BAP1缺陷细胞中的再表达 SLC7A11在BAP1 WT或C91A细胞中的表达和H2Aub占据 铁死亡抑制剂（ferrostatin-1、liproxstatin-1）和铁螯合剂（DFO）对细胞死亡的 rescue 裸鼠移植瘤中BAP1再表达和SLC7A11回复的肿瘤生长 癌症相关BAP1突变体对SLC7A11抑制和铁死亡促进的丧失
摘要
铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡，其在癌症中的作用和调控机制尚不清楚。肿瘤抑制因子BRCA1相关蛋白1（BAP1）编码一种核去泛素化（DUB）酶，可减少染色质上的组蛋白2A泛素化（H2Aub）。在这里，整合的转录组、表观基因组和癌症基因组分析将BAP1与代谢相关的生物学过程联系起来，并确定胱氨酸转运蛋白SLC7A11是人类癌症中BAP1的关键靶基因。功能研究表明，BAP1以减少H2Aub在SLC7A11启动子上的占据，并以DUB依赖的方式抑制SLC7A11表达，且BAP1通过抑制SLC7A11表达来抑制胱氨酸摄取，导致脂质过氧化和铁死亡升高。此外，我们表明BAP1部分通过SLC7A11和铁死亡来抑制肿瘤发展，并且癌症相关的BAP1突变体失去了抑制SLC7A11和促进铁死亡的能力。总之，我们的结果揭示了一种先前未被认识的表观遗传机制，将铁死亡与肿瘤抑制联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BAP1如何通过表观遗传机制调控铁死亡，并将其与肿瘤抑制功能联系起来？
- 核心机制
- BAP1作为DUB酶去除SLC7A11启动子上的H2Aub，抑制SLC7A11表达，减少胱氨酸摄取和GSH合成，增加脂质过氧化并促进铁死亡，从而部分抑制肿瘤发展。
- 主要证据
- 整合转录组、表观基因组和癌症基因组分析确定SLC7A11为BAP1靶基因；功能实验表明BAP1以DUB依赖方式抑制SLC7A11表达和胱氨酸摄取，促进铁死亡；移植瘤实验显示BAP1通过SLC7A11和铁死亡部分抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了一种连接铁死亡与肿瘤抑制的表观遗传机制，表明BAP1-SLC7A11-铁死亡轴可能介导BAP1的肿瘤抑制功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
癌症基因组分析筛选BAP1相关靶基因
利用TCGA数据鉴定与BAP1介导的肿瘤抑制最相关的靶基因。
对541个BAP1调控基因进行表达相关性、肿瘤vs正常表达和生存分析，聚焦SLC7A11。
验证BAP1对SLC7A11表达的调控
确定BAP1是否以DUB活性依赖方式抑制SLC7A11表达。
在UMRC6、NCI-H226、786-O、Caki1、ACHN等细胞中操作BAP1表达，用RT-PCR、Western blot和荧光素酶报告基因检测SLC7A11表达。
验证BAP1对SLC7A11启动子H2Aub和转录的影响
确定BAP1是否减少SLC7A11启动子H2Aub并影响转录起始和延伸。
用H2Aub ChIP-seq和ChIP-qPCR检测SLC7A11启动子和外显子区域的H2Aub、RNA Pol II、S5-CTD和S2-CTD结合。
验证BAP1对胱氨酸摄取和铁死亡的影响
确定BAP1是否通过抑制SLC7A11减少胱氨酸摄取并促进铁死亡。
测量胱氨酸摄取、GSH水平、脂质过氧化，并用erastin、TBH、胱氨酸剥夺诱导铁死亡，用ferrostatin-1、DFO、Z-VAD-fmk、necrostatin-1s进行 rescue。
验证SLC7A11在BAP1调控铁死亡中的介导作用
确定BAP1促进铁死亡是否主要通过抑制SLC7A11。
在BAP1再表达细胞中回复SLC7A11，或在BAP1缺陷细胞中敲低SLC7A11，检测胱氨酸摄取、脂质过氧化和铁死亡敏感性。
验证BAP1通过SLC7A11和铁死亡抑制体内肿瘤发展
确定BAP1的肿瘤抑制功能是否部分通过SLC7A11和铁死亡实现。
裸鼠皮下移植瘤实验，检测肿瘤生长，并用电镜和4HNE IHC分析铁死亡特征，用liproxstatin-1处理。
分析癌症相关BAP1突变对SLC7A11和铁死亡的影响
确定癌症相关BAP1突变是否影响SLC7A11调控、铁死亡和肿瘤抑制。
在UMRC6细胞中表达8个癌症相关BAP1突变体，检测SLC7A11表达、铁死亡敏感性和锚定非依赖生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 药物处理 | erastin | Sigma | E7781 |
| ferrostatin-1 | Sigma | SML0583 | |
| TBH | Sigma | 458139 | |
| Z-VAD-fmk | R&D Systems | FMK001 | |
| Necrostatin-1s | BioVision | 2263 | |
| 星形孢菌素 | LC Laboratories | S-9300 | |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | Roche | -- |
| BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen | D3861 | |
| 细胞活力检测 | Cell Counting Kit-8 | Sigma | -- |
| 胱氨酸摄取实验 | [14C]胱氨酸 | PerkinElmer | -- |
| GSH检测 | GSH-Glo谷胱甘肽检测 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | BAP1抗体 | Santa Cruz | sc-28383 |
| SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | -- | |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP酶解染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| H2Aub抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 | |
| RNA聚合酶II CTD抗体 | Cell Signaling Technology | 2629 | |
| RNA聚合酶II CTD磷酸化Ser5抗体 | Active Motif | 61085 | |
| RNA聚合酶II CTD磷酸化Ser2抗体 | Active Motif | 61083 | |
| FOXK1抗体 | Abcam | ab18196 | |
| FOXK2抗体 | Bethyl Laboratories | A301-730A | |
| HCFC1抗体 | Bethyl Laboratories | A301-399A | |
| OGT抗体 | Cell Signaling Technology | 5368 | |
| KDM1B抗体 | Abcam | ab193080 | |
| ASXL1抗体 | Santa Cruz | sc-293204 | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| Western blot | BAP1抗体 | Santa Cruz | sc-28383 |
| SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| 微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| H2Aub抗体 | Millipore | 05-678 | |
| H2A抗体 | Millipore | ABE327 | |
| vinculin抗体 | Sigma | V4505 | |
| p53抗体 | Santa Cruz | sc-126 | |
| PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| β-actin抗体 | Abcam | ab8226 | |
| V5抗体 | Sigma | A8012 | |
| 免疫组织化学 | 抗4HNE抗体 | Abcam | ab46545 |
| 动物实验 | liproxstatin-1 | Sigma | SML1414 |
| ChIP-seq | H2Aub抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 |
| H2Av抗体 | ActiveMotif | 61686 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞死亡/活力检测 | erastin浓度（10-20 µM）、处理时间（24-30 hr）、ferrostatin-1浓度（2 µM）、DFO浓度（100 µM）、Z-VAD-fmk浓度（5 µM）、necrostatin-1s浓度（2 µM） 阅读提示：Methods中Cell death/viability/proliferation assays小节及图4、5、7图注 |
| 胱氨酸摄取实验 | [14C] cystine用量（0.04 μCi）、孵育时间、DMEM中胱氨酸浓度（200 µM） 阅读提示：Methods中Cystine uptake assay小节 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11浓度（5 µM）、孵育时间（30 min） 阅读提示：Methods中Lipid peroxidation assay小节 |
| 移植瘤实验 | 小鼠品系（雌性4-6周龄athymic nude mice Foxn1nu/Foxn1nu）、细胞注射数量（文中未明确说明）、liproxstatin-1剂量（10 mg/kg，腹腔注射，每两天一次） 阅读提示：Methods中Xenograft model小节及图6图注 |
| ChIP-qPCR | 抗体用量（H2Aub 5 μL用于ChIP-seq；ChIP-qPCR抗体浓度文中未明确说明）、ChIP试剂盒（SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit） 阅读提示：Methods中Real-time PCR and ChIP-qPCR小节及ChIP-seq小节 |