鉴定LIN28磷酸化位点
确定LIN28在PSCs中的磷酸化位点
使用靶向磷酸化蛋白质组学策略在mESCs中映射磷酸化位点，结合先前数据生成LIN28磷酸化图谱。
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MAPK/ERK对LIN28的磷酸化将信号传导与多能性的转录后调控耦联
LIN28 phosphorylation by MAPK/ERK couples signalling to the post-transcriptional control of pluripotency.
实验完整度
高包含体外细胞模型、磷酸化位点鉴定、功能验证（重编程、克隆实验）及多种分子机制验证（Western blot、RIP-seq等）
主要模型
人胚胎癌细胞PA1 人胚胎干细胞hESCs 小鼠胚胎干细胞v6.5 HeLa Flp-In细胞
重点核对
LIN28 S200磷酸化位点的鉴定与验证（质谱和Western blot） MEK/ERK抑制剂PD0325901对S200磷酸化的影响 磷酸化模拟/缺失突变体（S200D/S200A）的蛋白稳定性与功能差异 重编程实验中TRA-1-60阳性集落计数 小鼠ESC克隆形成实验中的碱性磷酸酶染色模式
摘要
信号传导和转录后基因调控对多能性调节都至关重要，但它们如何整合影响细胞身份仍知之甚少。LIN28（也称为LIN28A）是一种高度保守的RNA结合蛋白（RBP），通过阻断let-7 microRNA（miRNA）生物发生和直接调节mRNA翻译，已成为细胞命运的核心转录后调节因子。我们在此表明，LIN28在多能干细胞（PSCs）中被MAPK/ERK磷酸化，通过翻译后稳定增加其水平。LIN28磷酸化对let-7影响不大，但增强了LIN28对其直接mRNA靶标的作用，揭示了一种解耦LIN28 let-7依赖性和非依赖性活性的机制。我们将此机制与体细胞重编程诱导多能性以及从naïve到primed多能性的转变联系起来。总之，我们的发现表明MAPK/ERK直接影响LIN28，定义了一个连接信号传导、转录后基因控制和细胞命运调节的轴。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MAPK/ERK信号通路如何通过转录后机制调控LIN28的功能和多能性？
- 核心机制
- MAPK/ERK磷酸化LIN28的S200位点，通过翻译后稳定增加LIN28蛋白水平，进而增强其对mRNA靶标的调控，但不影响let-7活性。
- 主要证据
- 在多种PSCs中验证S200磷酸化；使用磷酸化模拟/缺失突变体证明蛋白稳定性和功能差异；重编程实验显示S200A降低、S200D提高重编程效率约50%；小鼠ESC实验证明S200D促进naïve向primed转变。
- 研究意义
- 揭示了MAPK/ERK直接调控RNA结合蛋白LIN28的机制，连接信号传导与转录后基因控制，为理解多能性转变和细胞命运调控提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MAPK/ERK磷酸化LIN28 S200
确定负责S200磷酸化的激酶
使用选择性抑制剂筛选、PMA刺激、MEK1突变体表达以及生长因子处理，通过Western blot检测S200磷酸化。
研究磷酸化对LIN28蛋白稳定性的影响
探究S200磷酸化是否影响LIN28蛋白稳定性
使用Calyculin A、PMA、MEK抑制剂处理，以及表达磷酸化模拟/缺失突变体的等基因细胞系，进行Western blot、qRT-PCR和放线菌酮追踪实验。
分析磷酸化对let-7和mRNA靶标的影响
确定S200磷酸化是否影响LIN28对let-7和mRNA靶标的调控
使用MEK抑制剂处理、LIN28敲低、RIP-qPCR、RIP-seq、qRT-PCR和Western blot检测let-7水平和mRNA靶标结合与蛋白表达。
评估磷酸化在重编程和多能性转变中的作用
检验S200磷酸化对LIN28促进重编程和naïve-primed转变的功能意义
进行因子重编程实验（OCT4、SOX2、NANOG联合LIN28变体）并计数TRA-1-60阳性集落；在mESCs中进行克隆形成实验和AP染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质谱分析 | QuikChange Lightning定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 细胞培养 | CF1小鼠胚胎成纤维细胞 | GlobalStem | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 白血病抑制因子 | -- | -- | |
| 敲除血清替代物 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 转染 | X-tremeGENE 9转染试剂 | Roche | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| siRNA | 对照siRNA | Ambion | 4390843 |
| LIN28A siRNA | Ambion | 4392420-s36195 | |
| 病毒浓缩 | Lenti-X浓缩试剂 | Clontech | -- |
| 药物处理 | 花萼海绵诱癌素A | Cell Signaling | -- |
| Torin1 | Tocris | -- | |
| PD0325901 | Stemgent | -- | |
| SB203580 | Invivogen | -- | |
| SP600125 | Sigma | -- | |
| 肯帕酮 | Sigma | -- | |
| LY294002 | Cell Signaling | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Gemini | -- | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| 佛波酯 | Cell Signaling | -- | |
| 多西环素 | Sigma | -- | |
| 亲和纯化 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| 质谱分析 | Bio-Safe考马斯亮蓝染色液 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| SuperSignal West Pico和Femto化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| Odyssey CLx近红外荧光成像系统 | LI-COR | -- | |
| 抗磷酸化LIN28(S200)抗体 | -- | -- | |
| 抗LIN28A抗体 | Cell Signaling | 3978 | |
| 抗α/β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling | 2148 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Sigma | E7028 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling | 4695 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-1616 | |
| 抗HA抗体 | Sigma | H6533 | |
| 抗RPS13抗体 | Abcam | ab104862 | |
| 抗RPL23抗体 | Proteintech | 16086-1-AP | |
| 抗NDUFB3抗体 | Abcam | ab55526 | |
| 抗NDUFB8抗体 | Abcam | ab110242 | |
| 抗NDUFB10抗体 | Proteintech | 15589-1-AP | |
| HRP标记抗兔IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| HRP标记抗鼠IgG | GE Healthcare | NA931 | |
| HRP标记抗羊IgG | Santa Cruz | sc-2020 | |
| IRDye 680RD抗兔IgG | LI-COR | 925-68071 | |
| IRDye 800CW抗鼠IgG | LI-COR | 925-32210 | |
| IRDye 680RD抗羊IgG | LI-COR | 925-68074 | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| miRNeasy柱 | Qiagen | -- | |
| miScript II逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| miScript miRNA检测试剂 | Qiagen | -- | |
| RNA免疫沉淀 | RNasin RNA酶抑制剂 | Promega | -- |
| RNA测序 | NEBNext Poly(A) mRNA磁珠分离模块 | NEB | -- |
| NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- | |
| Bioanalyzer生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 重编程 | 生物素标记抗TRA-1-60抗体 | eBioscience | 13-8863-82 |
| 链霉亲和素-HRP | Biolegend | 405210 | |
| DAB过氧化物酶试剂盒 | Vector Labs | -- | |
| 克隆形成实验 | 白细胞碱性磷酸酶试剂盒 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LIN28磷酸化位点鉴定 | 小鼠ESCs的品系和培养条件、质谱分析参数 阅读提示：Methods中的Mass Spectrometry部分和Supplementary Fig. 1 |
| MAPK/ERK磷酸化LIN28 S200验证 | 细胞类型（PA1、293T）、抑制剂浓度（PD0325901 1 µM、SB203580 2 µM等）、处理时间（30分钟至60分钟）、血清饥饿时间（16-20小时） 阅读提示：Figure 1图注和Methods中的Drug Treatments部分 |
| LIN28蛋白稳定性分析 | PMA浓度（200 nM）、处理时间（3小时）、CHX浓度（100 µg/ml）、Doxycycline浓度（100 ng/ml） 阅读提示：Figure 2图注和Methods中的Drug Treatments部分 |
| 重编程实验 | dH1f成纤维细胞接种密度（2.5 × 105 cells/well）、病毒转导条件、TRA-1-60染色条件、重编程效率定量方法 阅读提示：Methods中的Reprogramming部分和Figure 4图注 |
| 小鼠ESC克隆形成实验 | 细胞接种密度（500 cells/well）、培养时间（5天）、AP染色分类标准 阅读提示：Methods中的Clonal Assay部分和Figure 4g图注 |