LINK-A在TNBC中的表达及预后分析
验证LINK-A在TNBC中的表达水平及与临床预后的相关性。
利用TCGA RNA-seq数据、RNAScope®组织芯片、qRT-PCR和生存分析，比较LINK-A在不同乳腺癌亚型中的表达及其与无复发生存的关系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LINK-A长链非编码RNA在三阴性乳腺癌中激活常氧条件下的HIF1α信号通路
The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer.
实验完整度
高包含细胞系、患者组织、动物移植瘤多层级证据，并进行了蛋白互作、磷酸化位点突变、激酶活性等功能与机制验证。
主要模型
MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞系 乳腺癌患者组织样本（组织芯片及新鲜冷冻组织） MDA-MB-231细胞皮下移植瘤裸鼠模型
重点核对
HB-EGF处理浓度10 ng/ml，处理时间30分钟（细胞信号实验） LINK-A敲低使用LNA#5或shRNA#1-4， rescue实验使用LNA#5抗性全长或缺失突变体 HIF1α磷酸化位点Tyr565和Ser797通过位点特异性抗体及Y565F/S797A突变体验证 MG-132预处理浓度10 µM，处理6小时（蛋白酶体抑制实验） 动物实验每组5只小鼠，皮下注射MDA-MB-231细胞（1:1 Matrigel），每5天测量肿瘤体积
摘要
尽管长链非编码RNA（lncRNA）主要定位于细胞核并在许多生物学过程中发挥功能，但其在细胞质信号转导中的潜在作用仍未被探索。在这里，我们鉴定了一个细胞质lncRNA——激酶激活长链基因间非编码RNA（LINK-A），它介导HB-EGF触发的、依赖EGFR:GPNMB异二聚体的HIF1α在Tyr565和Ser797位点分别被BRK和LRRK2磷酸化。这些事件导致常氧条件下HIF1α稳定、HIF1α与p300相互作用以及HIF1α转录程序的激活。机制上，LINK-A促进BRK招募至EGFR:GPNMB复合物并激活BRK激酶。BRK依赖的HIF1α Tyr565磷酸化干扰Pro564羟基化，导致常氧下HIF1α稳定。LINK-A和LINK-A依赖的信号通路激活均与TNBC相关，促进乳腺癌糖酵解重编程和肿瘤发生。我们的发现阐明了细胞质lncRNA在信号转导中的规模和多样性，并强调了lncRNA在癌症中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞质lncRNA是否参与调控细胞质信号转导，及其在TNBC常氧HIF1α稳定中的作用机制。
- 核心机制
- HB-EGF触发EGFR:GPNMB异二聚体形成，LINK-A招募BRK和LRRK2分别磷酸化HIF1α Tyr565和Ser797；Tyr565磷酸化抑制Pro564羟基化从而稳定HIF1α，Ser797磷酸化促进HIF1α-p300互作并激活转录程序。
- 主要证据
- 在TNBC细胞系中通过RNA pulldown、RIP、共免疫沉淀、体外激酶实验、位点突变、ChIP-seq、糖酵解测定及小鼠移植瘤模型，证实LINK-A依赖的信号通路促进HIF1α靶基因表达和肿瘤生长；患者组织芯片显示LINK-A及磷酸化蛋白水平与TNBC和不良预后相关。
- 研究意义
- 揭示了细胞质lncRNA调控信号转导的新机制，提示LINK-A及其信号通路可作为TNBC潜在的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LINK-A与蛋白质互作鉴定
鉴定LINK-A结合的蛋白质并验证直接互作。
RNA pulldown联合质谱、RIP-qPCR、体外RNA-蛋白质结合实验及dot-blot，确定LINK-A与BRK、LRRK2的直接结合及结构域和RNA基序。
HB-EGF诱导的EGFR:GPNMB信号通路验证
确认HB-EGF特异性诱导EGFR:GPNMB异二聚体及下游磷酸化事件。
用不同生长因子处理细胞，免疫共沉淀和交联实验检测EGFR-GPNMB互作，免疫印迹检测GPNMB Tyr525、BRK Tyr351和HIF1α磷酸化。
LINK-A介导BRK招募和激活的验证
验证LINK-A在BRK招募至GPNMB及BRK激活中的作用。
免疫荧光和免疫印迹检测LINK-A敲低对BRK与EGFR共定位、BRK Tyr351磷酸化的影响，并进行LINK-A缺失突变体rescue实验。
LINK-A诱导BRK构象变化及激酶活性测定
验证LINK-A结合BRK后诱导构象变化并增强激酶活性。
体外激酶实验检测BRK自磷酸化和对HIF1α肽段的磷酸化，Caspase-1有限水解实验检测BRK构象变化。
HIF1α磷酸化、羟基化及稳定性调控验证
验证BRK和LRRK2对HIF1α特定位点的磷酸化及其对羟基化和稳定性的影响。
体外激酶和羟基化实验、LC-MS分析、CHX追踪实验、免疫印迹检测HIF1α磷酸化、羟基化、半衰期及与p300/FIH的相互作用。
LINK-A依赖的HIF1α转录程序及糖酵解表型验证
验证LINK-A对HIF1α转录活性和糖酵解的影响。
ChIP-seq和ChIP-qPCR检测HIF1α靶基因启动子占据，qRT-PCR检测靶基因表达，葡萄糖摄取和乳酸生成实验检测糖酵解。
体内肿瘤生长及临床样本相关性验证
验证LINK-A依赖信号通路在体内肿瘤生长中的作用及与TNBC临床病理特征的相关性。
小鼠皮下移植LINK-A敲低的MDA-MB-231细胞，观察肿瘤生长；免疫组化检测TNBC组织芯片中磷酸化蛋白水平，分析其与LINK-A表达及预后的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA检测 | RNAScope® 2.0 HD检测试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 412027 |
| BCAR4 RNAScope®探针 | Advanced Cell Diagnostics | 407777 | |
| HOTAIR RNAScope®探针 | Advanced Cell Diagnostics | 312347 | |
| RNA FISH | 靶向LINK-A的LNA™ FISH探针 | Exiqon | -- |
| 靶向β-肌动蛋白的LNA™ FISH探针 | Exiqon | 300512-04 | |
| RACE分析 | SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 | Clontech | -- |
| Northern blot | NorthernMax®试剂盒 | Ambion | -- |
| 质粒构建 | QuikChange™ Lightning定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine® 3000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| DharmaFECT4转染试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 慢病毒包装 | ViraPower慢病毒表达系统 | Life Technologies | -- |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 细胞处理 | InSolution™ MG-132蛋白酶体抑制剂 | EMD Millipore | -- |
| 细胞裂解 | ProteaPrep两性离子细胞裂解试剂盒（质谱级） | Protea® | -- |
| RNA pulldown | BcMag™单体亲和素磁珠 | Bioclone | -- |
| 体外激酶实验 | 通用激酶活性检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 葡萄糖摄取实验 | 细胞葡萄糖摄取检测试剂盒 | Cayman Chemical | -- |
| 乳酸生成实验 | L-乳酸检测试剂盒 | Cayman Chemical | -- |
| 体外翻译 | TnT®快速偶联转录/翻译试剂盒 | Promega | -- |
| 体外翻译检测 | Transcend™非放射性翻译检测系统 | Promega | -- |
| 蛋白纯化 | 蛋白质纯化试剂盒 | Clontech | -- |
| 抗体 | 抗EGFR（D38B1）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4267 |
| 抗GPNMB（E1Y7J）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13251 | |
| 抗LRRK2抗体 | Cell Signaling Technology | 5559 | |
| 抗磷酸化EGFR（Tyr1068）（D7A5）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| 抗羟基化HIF1α（Pro564）（D43B5）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3434 | |
| 抗FIH（H-299）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48813 | |
| 抗BRK（C-18）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1118 | |
| 抗HIF1α（28b）鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13515 | |
| 抗磷酸酪氨酸（4G10）铂金鼠单克隆抗体 | Millipore | 05-1050X | |
| 抗p300（NM11）鼠单克隆抗体 | Active Motif | 61402 | |
| 抗磷酸化GPNMB（Tyr525）抗体 | YenZym Antibodies, LLC | -- | |
| 抗磷酸化BRK（Tyr351）抗体 | YenZym Antibodies, LLC | -- | |
| 抗磷酸化HIF1α（Tyr565）抗体 | YenZym Antibodies, LLC | -- | |
| 抗磷酸化HIF1α（Ser797）抗体 | YenZym Antibodies, LLC | -- | |
| siRNA | 靶向LINK-A的Lincode SMARTpool siRNA | Dharmacon | R-027622 |
| 靶向EGFR的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-003114 | |
| 靶向GPNMB的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-011741 | |
| 靶向PTK6/BRK的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-003166 | |
| 靶向LRRK2的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Dharmacon | L-006323 | |
| LNA | LNA™ GapmeR阴性对照 | Exiqon | -- |
| LNA™ GapmeR LINK-A #5 | Exiqon | -- | |
| 重组蛋白 | 重组Flag-GPNMB蛋白 | Origene | -- |
| 重组PHD1蛋白 | Origene | -- | |
| GST-EGFR蛋白 | Active Motif | -- | |
| HIF1α蛋白 | Novus Biologicals | -- | |
| BRK蛋白 | Novus Biologicals | -- | |
| LRRK2蛋白 | SignalChem | -- | |
| 重组活性Caspase-1 | R&D Systems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源（ATCC或MD Anderson核心设施）、支原体检测（Lonza MycoAlert kit）、血清饥饿过夜、生长因子浓度（EGF 10 ng/ml，HB-EGF 10 ng/ml等）及处理时间30分钟 阅读提示：Methods中'Cell culture, transfection, and lentiviral transduction'及'Cell treatments, cross-linking, fractionation, cell lysis, immunoprecipitation and immunoblotting'小节 |
| RNA pulldown与质谱 | 细胞裂解液蛋白量（30 mg）、RNA量（20 µg）、孵育时间（4小时，4°C）、洗涤缓冲液盐浓度（NT2-high salt含500 mM或1 M NaCl）、洗脱条件（2 mM D-biotin） 阅读提示：Methods中'RNA pulldown, mass spectrometry analysis, in vitro RNA-protein binding assay and in vitro RNA-protein binding coupled with dot-blot assay'小节 |
| 体外激酶与羟基化实验 | 激酶反应缓冲液（SignalChem buffer II）、ATP浓度（100 µM冷ATP或10 µCi [γ-32P] ATP）、反应时间（1小时，30°C）；羟基化反应中PHD1量（1 µg）、HIF1α量（5 µg）、FeSO4 10 µM、2-氧戊二酸100 µM、抗坏血酸1 mM、DTT 100 µM，37°C 1小时 阅读提示：Methods中'In vitro kinase assay'及'In vitro HIF1α hydroxylation assay'小节 |
| 体内肿瘤实验 | 小鼠品系（雌性裸鼠，6-8周龄）、每组5只、细胞注射量（30 µl生长培养基与Matrigel 1:1混合）、注射部位（皮下）、测量频率（每5天）、肿瘤体积计算公式（0.54×L×W2） 阅读提示：Methods中'In vivo tumorigenesis study'小节 |
| 临床样本与组织染色 | 组织芯片来源（Biomax、Biochain、USbiolabs）、新鲜冷冻组织队列（南京和Duke）、抗体稀释度（免疫组化1:200）、染色定量方法（Image-Pro plus 6.0或RNAscope® SpotStudio） 阅读提示：Methods中'Tissue samples'和'RNAScope® assay, RNA FISH, immunofluorescence and immunohistochemistry'小节，以及图1、图6图注 |