建立肝细胞衰老损伤模型
验证Mdm2在肝细胞中诱导性敲除能否引起p53/p21介导的肝细胞衰老和损伤。
利用AhCre+Mdm2flox/flox小鼠，i.p.注射βNF诱导Cre重组，检测p53、p21表达、Mdm2基因组重组、血清AST/胆红素/白蛋白、H&E和TUNEL。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
具有肝脏再生能力的胆管来源肝祖细胞
Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.
实验完整度
高含肝细胞特异性Mdm2敲除小鼠模型、Fn14KO遗传验证、体外HPC分离扩增及移植重建实验
主要模型
AhCre+Mdm2flox/flox小鼠 AhCre+Mdm2flox/−小鼠 Fn14KO AhCre+Mdm2flox/flox小鼠 CDE饮食小鼠及体外扩增cdHPCs
重点核对
βNF诱导剂量20-80mg/kg及给药途径i.p. Mdm2重组效率：肝细胞exon5减少96.8%，NPC仅0.8% Fn14KO后ΔMdm2小鼠10天内全部死亡，而Fn14WT组80%存活至30天 移植实验：5×10^6 GFP-cdHPCs脾内注射，每10天20mg/kg βNF重复诱导 TWEAK给药：0.4μg i.v.于-5、-3、-1和1天共4次
摘要
肝细胞和胆管细胞在肝损伤后自我更新。严重损伤后肝细胞日益衰老，此时肝祖细胞（HPCs）是否参与肝再生尚不清楚。本文描述了一种小鼠模型，其中Mdm2在超过98%的肝细胞中被诱导性敲除，引起凋亡、坏死和衰老，几乎所有肝细胞表达p21。这导致显著的HPC激活，且该激活为生存所必需，随后实现完全的功能性肝脏重建。使用细胞表面标志物从遗传正常小鼠中分离的HPCs在体外高度可扩增且表型稳定。这些HPCs被移植到成年小鼠肝脏中，其中肝细胞Mdm2被反复敲除，形成非竞争性再生重建实验。移植的HPCs显著促进肝实质恢复，再生肝细胞和胆管上皮，突显其体内谱系潜能。因此，HPCs是未来替代肝细胞或肝移植治疗肝病的潜在选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 严重肝损伤伴广泛肝细胞衰老时，胆管来源的肝祖细胞（HPCs）是否能够再生肝实质并恢复肝功能。
- 核心机制
- 肝细胞Mdm2缺失导致p53积累和p21介导的衰老，激活TWEAK/Fn14依赖的胆管反应，HPCs增殖并分化为肝细胞和胆管上皮以重建肝实质。
- 主要证据
- AhCre+Mdm2flox/flox小鼠中>98%肝细胞发生Mdm2重组并表达p53/p21，HPC标志物panCK/EpCAM/CD24/CD133显著扩增；Fn14KO使HPC扩增失败且小鼠死亡；CD45−/CD31−/Ter119−/EpCAM+/CD24+/CD133+ cdHPCs移植后GFP+细胞共表达HNF4α/CYP2D6和panCK/SOX9，改善组织学和血清白蛋白。
- 研究意义
- 作者提出HPCs是未来替代肝细胞或肝移植治疗肝病的潜在细胞治疗来源，并证明移植HPCs可长期重建受损肝脏的结构和功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
观察胆管反应和HPC激活
确定肝细胞衰老损伤后是否激活胆管反应及HPC扩增。
panCK、EpCAM、CD24、CD133免疫染色和FACS，检测HPC标志物mRNA表达，BrdU标记增殖。
长期观察HPC介导的肝再生
评估HPCs能否在长期内重建肝实质。
使用AhCre+Mdm2flox/−小鼠，βNF诱导后追踪p53阳性肝细胞比例变化、panCK+胆管反应消退、R26RLacZ报告基因丢失和纤维化。
Fn14KO验证HPC必要性
验证HPC激活对肝再生的必要性。
将AhCre+Mdm2flox/flox与Fn14KO杂交，βNF诱导后追踪30天生存、panCK+ HPC数量和NFκB p65活性。
TWEAK处理验证HPC激活
验证TWEAK/Fn14信号对胆管反应和HPC扩增的促进作用。
ΔMdm2小鼠在损伤期间接受4次i.v. TWEAK，检测panCK+ HPC数量和p53阴性肝细胞频率。
分离和体外扩增cdHPCs
建立表型稳定的HPC体外扩增体系。
CDE饮食诱导胆管反应，FACS分选CD45−/CD31−/Ter119−/EpCAM+/CD24+/CD133+细胞，克隆密度培养，检测克隆形成率、核型和标志物表达。
移植cdHPCs验证体内重建能力
验证体外扩增HPCs能否在体内重建受损肝脏。
GFP标记cdHPCs经脾内移植到预先低剂量βNF处理的AhCre+Mdm2flox/flox小鼠，每10天重复βNF诱导肝细胞损伤，3个月后检测GFP+细胞、肝细胞/胆管标志物、组织学和血清白蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | β-萘黄酮 | Sigma UK | -- |
| 他莫昔芬 | Sigma UK | -- | |
| 溴脱氧尿苷 | Amersham | -- | |
| 重组小鼠TWEAK | R and D Systems | -- | |
| 肝细胞分离 | 肝脏灌注培养基 | Gibco | -- |
| 肝脏消化培养基 | Gibco | -- | |
| Percoll密度梯度介质 | Sigma | -- | |
| HPC分离 | 抗小鼠CD16/32抗体 | eBiosciences | -- |
| EpCAM-APC偶联抗体 | eBiosciences | -- | |
| CD24-PeCy7偶联抗体 | -- | -- | |
| CD133-FITC偶联抗体 | -- | -- | |
| CD45-PE偶联抗体 | Biolegend | -- | |
| CD31-PE偶联抗体 | Biolegend | -- | |
| Ter119-PE偶联抗体 | Biolegend | -- | |
| HPC培养 | Williams' E培养基 | Gibco | -- |
| 鼠尾胶原1 | Sigma | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒溶液 | Gibco | -- | |
| 白细胞介素-6 | Peprotech | -- | |
| 肝细胞生长因子 | Peprotech | -- | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| HPC传代 | 无EDTA胰蛋白酶 | -- | -- |
| 敲除血清替代物 | -- | -- | |
| 流式分析 | 细胞解离培养基 | GIBCO | -- |
| 免疫组化 | Alexa 488荧光染料 | Invitrogen | A21206 |
| Alexa 555荧光染料 | Invitrogen | A21434 | |
| Alexa 650荧光染料 | Invitrogen | A21448 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector | -- | |
| TUNEL检测 | DeadEnd比色法TUNEL系统 | Promega | TB199 |
| 细胞移植 | 基质胶 | BD | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Qiagen Effectene转染试剂 | Qiagen | -- |
| 体外分化 | 小鼠重组Wnt3a | R&D systems | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| qPCR | Quantifast定量PCR试剂 | Qiagen | -- |
| Quantitect引物 | Qiagen | -- | |
| Roche Lightcycler 480实时PCR仪 | Roche | -- | |
| 血清分析 | 丙氨酸转氨酶检测试剂盒 | Alpha Laboratories Ltd | -- |
| 微量白蛋白检测试剂盒 | Olympus Diagnostics Lt | -- | |
| 天冬氨酸转氨酶检测试剂盒 | Randox Laboratories | -- | |
| 碱性磷酸酶检测试剂盒 | Randox Laboratories | -- | |
| 细胞表型分析 | Operetta高内涵分析系统 | PerkinElmer | -- |
| Columbus图像数据存储与分析系统 | -- | -- | |
| 核型分析 | 秋水仙胺 | Gibco | -- |
| DAPI荧光封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| 显微镜观察 | Zeiss Axiovert 200显微镜 | Zeiss | -- |
| Zeiss Axiocam MR相机 | Zeiss | -- | |
| 共聚焦分析 | Leica SP5共聚焦系统 | Leica | -- |
| 吸光度检测 | SPECTROstar Omega分光光度计 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Mdm2诱导敲除与肝损伤模型 | βNF剂量（20、40、80mg/kg）、i.p.给药、1% w:v玉米油配制、诱导后取样时间点 阅读提示：Methods 动物模型及Figure 1a时间轴 |
| HPC扩增检测 | CDE饮食12天、FACS门控策略、克隆密度250 cells/cm2、扩增培养基组分 阅读提示：Methods HPC isolation、Colony forming assay、Expansion of HPCs及Figure 7d |
| Fn14KO遗传验证 | Fn14KO小鼠来源（Biogen Idec）、βNF 80mg/kg、生存追踪30天、每组n=7 阅读提示：Methods 动物模型及Figure 5b-d图注 |
| TWEAK给药实验 | TWEAK 0.4μg i.v.、给药时间点-5、-3、-1和1天、βNF 80mg/kg 阅读提示：Methods 动物模型及Figure 6a图注 |
| HPC移植实验 | 受体AhCre+Mdm2flox/flox、移植前4天10mg/kg βNF、5×10^6 GFP-cdHPCs脾内注射、每10天20mg/kg βNF、12周检测 阅读提示：Methods Cell Transplantation Assay及Figure 8a图注 |