建立诱导型Gpx4敲除小鼠并评估表型
验证Gpx4在体内的必要性及敲除是否引起急性肾衰竭和死亡。
使用CreERT2;Gpx4fl/fl小鼠，他莫昔芬喂养诱导Gpx4敲除，监测生存、肾脏形态、蛋白尿和组织学。
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铁死亡调节因子Gpx4的失活引发小鼠急性肾衰竭
Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in mice.
实验完整度
高包含诱导型Gpx4−/−小鼠、细胞模型、人细胞及肝缺血/再灌注模型，并有功能与机制验证
主要模型
TAM诱导型Gpx4−/−小鼠胚胎成纤维细胞（Pfa1） TAM诱导型Gpx4−/−小鼠 人肾近端小管上皮细胞（HRPTEpiCs）和HK-2细胞 小鼠肝缺血/再灌注模型
重点核对
TAM诱导Gpx4敲除：Pfa1细胞用1 μM TAM处理，72 h后检测细胞活力 Liproxstatin-1体内给药：10 mg kg−1，每日腹腔注射，从TAM第4天开始 肝缺血/再灌注模型：C57BL/6J小鼠，缺血90 min后再灌注24 h 细胞活力检测：AquaBluer或LDH释放，通常处理后72 h（FINs处理24 h） 脂质过氧化检测：BODIPY 581/591 C11染色，48 h后流式分析
摘要
铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡，由小分子在特定肿瘤类型以及过表达致癌RAS的工程细胞中诱导。然而，其在非转化细胞和组织中的相关性尚未探索，仍然是个谜。在此，我们提供了直接的遗传学证据，证明谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）的敲除以一种病理相关的铁死亡形式导致细胞死亡。使用诱导型Gpx4−/−小鼠，我们阐明了谷胱甘肽/Gpx4轴在防止脂质氧化诱导的急性肾衰竭及相关死亡中的关键作用。我们进一步系统评估了一个小分子库以寻找可能的铁死亡抑制剂，从而发现了一种称为Liproxstatin-1的强效螺喹喔啉胺衍生物，它能够在细胞、Gpx4−/−小鼠以及缺血/再灌注诱导的肝损伤临床前模型中抑制铁死亡。总之，我们证明铁死亡是一种普遍且动态的细胞死亡形式，当被阻止时，有望提供实质性的细胞保护。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Gpx4失活是否在体内引发铁死亡，以及铁死亡是否参与急性肾衰竭和缺血/再灌注损伤等病理过程。
- 核心机制
- Gpx4失活导致脂质过氧化物（包括PC、PE和CL的氢过氧化物）积累，触发不依赖caspase和Rip1/Rip3的铁死亡，引起肾小管上皮细胞死亡和急性肾衰竭。
- 主要证据
- 诱导型Gpx4−/−小鼠出现急性肾衰竭和早期死亡；Gpx4−/−细胞发生可被Fer1、DFO、αToc和Nec1 rescue的铁死亡；脂质组学显示Gpx4−/−肾脏中PC、PE和CL的氢过氧化物增加；Liproxstatin-1在细胞和小鼠中抑制铁死亡并延长生存。
- 研究意义
- 证明铁死亡是体内重要的细胞死亡形式，Gpx4/谷胱甘肽轴防止急性肾衰竭，铁死亡抑制剂可能用于缺血/再灌注等病理条件下的细胞保护。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定细胞死亡模式为铁死亡
明确Gpx4缺失诱导的细胞死亡是否依赖caspase、Rip1/Rip3或铁死亡通路。
在Pfa1细胞中TAM诱导Gpx4敲除，使用z-VAD-FMK、Nec1、Fer1、DFO、αToc等抑制剂，并敲低Rip1/Rip3。
分析脂质过氧化及脂质介质释放
表征Gpx4缺失诱导的铁死亡中的脂质氧化特征。
使用BODIPY 581/591 C11检测脂质过氧化，LC-MS/MS定量HETE释放，氧化脂质组学分析肾脏磷脂氢过氧化物。
筛选并鉴定铁死亡抑制剂Liproxstatin-1
发现具有体内活性的铁死亡抑制剂。
在TAM诱导的Gpx4−/− MEFs中筛选>40,000个小分子，鉴定螺喹喔啉胺衍生物Liproxstatin-1，并测试其特异性及ADME参数。
验证Liproxstatin-1在体内及人细胞中的保护作用
评估Liproxstatin-1对Gpx4−/−小鼠急性肾衰竭、肝缺血/再灌注损伤及人肾小管细胞铁死亡的作用。
Gpx4−/−小鼠每日腹腔注射Liproxstatin-1（10 mg kg−1），监测生存和TUNEL；肝缺血/再灌注模型检测AST/ALT和坏死面积；HRPTEpiCs和HK-2细胞中测试Liproxstatin-1对RSL3诱导铁死亡的 rescue。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| AquaBluer细胞活力检测染料 | MultiTarget Pharmaceuticals, LLC | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞毒性检测试剂盒（LDH） | Roche Diagnostics Deutschland | -- |
| Western blot | 抗Gpx4抗体（1B4） | -- | -- |
| 抗Gpx4抗体（ab125066） | Abcam | ab125066 | |
| 抗Rip3抗体（hGTX107574） | Genetex | hGTX107574 | |
| 抗Rip1抗体（3493） | Cell Signaling Technologies | 3493 | |
| 抗β-actin抗体（A5441） | Sigma | A5441 | |
| 免疫组化 | 兔抗磷酸化组蛋白H3抗体（9701） | Cell Signaling Technology | 9701 |
| 大鼠抗F4/80抗体（BM4007） | Acris Antibodies GmbH | BM4007 | |
| 兔抗Cleaved Caspase-3抗体（9664） | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 兔抗Gpx4抗体（3649-1） | Epitomics | 3649-1 | |
| 生物素化兔抗大鼠IgG（BA-4000） | Vector Laboratories | BA-4000 | |
| 生物素化山羊抗兔IgG（BA-1000） | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vector ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| Vector DAB试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| TUNEL检测 | ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒（S7100） | Serologicals, Millipore | S7100 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen | -- |
| 线粒体靶向BODIPY 581/591 C11 | -- | -- | |
| 流式分析 | BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD | -- |
| 透射电子显微镜 | Zeiss Libra 120 Plus透射电子显微镜 | Carl Zeiss NTS GmbH | -- |
| siRNA转染 | Hyperfect转染试剂 | Qiagen | -- |
| Ripk1 siRNA（GS19766） | Qiagen | GS19766 | |
| Ripk3 siRNA（GS56532） | Qiagen | GS56532 | |
| Scp2 siRNA（GS20280） | Qiagen | GS20280 | |
| On-Target Plus SMARTpool人GPX4 siRNA（L-011676-00-0005） | Thermo Scientific Dharmacon | L-011676-00-0005 | |
| LC-MS/MS | C18 Spherisorb ODS2色谱柱（5 μm，150 × 4.6 mm） | Waters | -- |
| Applied Biosystems 4000 Q-Trap质谱仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 氧化脂质组学 | QExactive轨道阱质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
| LXQ离子阱质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 血清生化检测 | Architect ci8200自动分析仪 | Abbott | -- |
| Dimension 1500 Vista分析仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 诱导型Gpx4敲除小鼠模型 | 小鼠品系（CreERT2;Gpx4fl/fl）、年龄（>8周）、性别（雌雄均有）、他莫昔芬给药方式（饮食）及持续时间；对照为CreERT2;Gpx4+/fl 阅读提示：Methods“Inducible disruption of Gpx4 in mice”及Figure 1c图注 |
| 细胞活力及铁死亡抑制剂处理 | 细胞系（Pfa1）、TAM浓度（1 μM）、接种密度（1,000 cells/well）、抑制剂浓度范围、检测时间（72 h）及检测方法（AquaBluer） 阅读提示：Methods“Cell viability assays and inhibitor studies”及Figure 1b、2a图注 |
| Liproxstatin-1体内给药 | 给药剂量（10 mg kg−1）、给药途径（i.p.）、给药频率（每日一次）、起始时间（TAM第4天）、溶剂（1% DMSO in PBS）及生存分析统计方法 阅读提示：Methods“Animal experiments (in vivo rescue experiment)”及Figure 7c图注 |
| 肝缺血/再灌注模型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（8–10周）、缺血时间（90 min）、再灌注时间（24 h）、检测指标（AST/ALT、坏死面积） 阅读提示：Methods“Animal experiments (liver ischaemia/reperfusion)”及Figure 7e图注 |
| 脂质过氧化检测 | 探针（BODIPY 581/591 C11）、染色时间（1 h）、检测时间点（48 h）、流式细胞仪型号（BD FACS Canto II） 阅读提示：Methods“Staining for lipid peroxidation in cells by flow cytometry”及Figure 3a图注 |