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        活细胞中的μMap邻近标记揭示应激颗粒解聚机制

        µMap proximity labeling in living cells reveals stress granule disassembly mechanisms.

        作者信息Chenmengxiao Roderick Pan, Steve D Knutson, Sean W Huth, David W C MacMillan
        PMID39215100
        期刊Nat Chem Biol
        发布时间2025-04
        DOI10.1038/s41589-024-01721-2
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含HEK293细胞系体外模型、多种细胞系验证及时间分辨蛋白质组学，并有siRNA敲低和抑制剂功能验证

        主要模型

        稳定表达HaloTag–G3BP1的HEK293细胞 稳定表达HaloTag–NES的HEK293细胞 HeLa细胞 SH-SY5Y细胞

        重点核对

        NaAsO2诱导应激颗粒的浓度为500 μM，处理时间30 min TAK-243使用浓度为2 μM，预孵育1 h并维持至实验结束 heclin使用浓度为25 μM，预孵育1 h siRNA敲低ITCH、NEDD4L、NDFIP1后检测应激颗粒解聚延迟 解聚时间点设置为去除应激源后30、60、120 min

        摘要

        相分离凝聚体是由动态蛋白质相互作用组成的无膜细胞内结构，组织着基本的生物学过程。理解这些细胞器的组成和动态有助于增进我们对与颗粒失调相关的细胞行为和疾病病理的认识。在本研究中，我们应用基于HaloTag平台的微环境作图技术（HaloMap）来表征活细胞内的应激颗粒动态。在验证了该方法的稳健性和灵敏度后，我们分析了应激颗粒在形成、解聚过程中以及药物扰动下的蛋白质组。这些实验揭示了多个泛素相关调节因子，包括HECT（与E6AP C端同源）E3连接酶ITCH和NEDD4L，以及泛素受体toll相互作用蛋白TOLLIP，作为颗粒解聚的关键介质。此外，我们还鉴定了一条促进颗粒清除的自噬相关通路。总之，这项工作建立了一种通用的光邻近标记方法，用于解析细胞内蛋白质相互作用组，并揭示了应激颗粒动态此前未探索的调控机制。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        应激颗粒解聚的细胞机制是什么，泛素化及自噬相关通路是否参与调控该过程？
        核心机制
        HECT家族E3连接酶ITCH和NEDD4L及其衔接蛋白NDFIP1在颗粒形成期间催化颗粒蛋白的K63连接多泛素化，泛素受体TOLLIP识别这些修饰并招募自噬 machinery，促进应激颗粒解聚。
        主要证据
        通过时间分辨HaloMap蛋白质组学鉴定解聚过程中富集的泛素相关蛋白；TAK-243和heclin抑制泛素化延迟颗粒解聚；siRNA敲低ITCH、NEDD4L、NDFIP1和TOLLIP均延迟解聚；TUBE pulldown显示heclin降低K63泛素化；自噬诱导剂Torin 1和TAT-D11加速颗粒清除。
        研究意义
        建立了通用的光邻近标记方法HaloMap用于解析细胞内蛋白质相互作用组，并揭示了应激颗粒动态的新调控机制，为神经退行性疾病研究提供潜在方向。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        HaloMap平台建立与验证

        验证HaloTag–G3BP1融合蛋白能否正确形成应激颗粒并用于邻近标记

        在HEK293细胞中稳定表达HaloTag–G3BP1，通过免疫荧光验证其亚细胞定位和应激颗粒形成能力；将Ir催化剂偶联至HaloTag，加入biotin–diazirine探针后蓝光照射标记邻近蛋白，检测生物素化信号与颗粒共定位

        2

        应激颗粒蛋白质组时间分辨分析

        鉴定应激颗粒形成和解聚过程中蛋白质组动态变化

        在应激状态及去除应激源后30、60、120 min进行HaloMap标记，以HaloTag–NES为对照，链霉亲和素富集后进行无标记定量LC–MS蛋白质组分析

        3

        泛素化在颗粒解聚中的功能验证

        验证泛素化对应激颗粒解聚的必要性

        使用泛素激活酶抑制剂TAK-243在不同时间窗口处理细胞，免疫荧光检测G3BP1颗粒解聚动力学；免疫荧光和Western blot检测泛素化水平；heclin抑制HECT E3连接酶后检测解聚延迟

        4

        泛素相关调节因子的鉴定与功能验证

        鉴定参与颗粒解聚的E3连接酶、衔接蛋白和泛素受体，并验证其功能

        在有无TAK-243条件下进行HaloMap蛋白质组分析，鉴定差异富集的泛素相关蛋白；通过siRNA敲低ITCH、NEDD4L、NDFIP1、TOLLIP等候选因子，免疫荧光检测颗粒解聚；免疫荧光验证候选蛋白与颗粒共定位；TUBE pulldown分析K63泛素化变化

        5

        自噬通路在颗粒解聚中的作用验证

        验证自噬 machinery 参与应激颗粒清除

        检测应激后LC3B-II水平及自噬体形成；使用BafA1抑制自噬体-溶酶体融合检测解聚延迟；使用Torin 1或TAT-D11预诱导自噬后检测颗粒形成大小和解聚速率

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光显微镜蛋白质印迹细胞活力检测活细胞共聚焦成像
        蛋白质组学与邻近标记
        HaloMap邻近标记链霉亲和素下拉无标记定量液相色谱-质谱蛋白质组学数据非依赖采集质谱
        验证分子表达与修饰变化
        TUBE下拉基因本体分析
        验证基因功能
        siRNA敲低瞬时转染
        数据分析与统计
        双尾Student t检验单因素方差分析及Tukey检验无监督聚类

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        泛素化抑制TAK-243MedChemExpressHY-100487
        HECT E3连接酶抑制heclinMedChemExpressHY-110204
        自噬诱导Torin 1MedChemExpressHY-13003
        自噬抑制巴弗洛霉素A1MedChemExpressHY-100558
        自噬诱导TAT-D11肽Novus BiologicalsNBP2-49888
        免疫荧光兔抗G3BP1抗体Cell Signaling Technology61559S
        鼠抗G3BP1抗体Proteintech66486-1-Ig
        鼠抗G3BP1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365338
        兔抗HaloTag抗体PromegaG928A
        兔抗PDIA6抗体Abcamab154820
        兔抗PUM3抗体Sigma-AldrichHPA002353
        兔抗RPL4抗体Sigma-AldrichHPA034600
        鼠抗泛素抗体Santa Cruz Biotechnologysc-8017
        鼠抗HA标签抗体Invitrogen26183
        兔抗K63泛素抗体Thermo Fisher ScientificMA532573
        兔抗K48泛素抗体Thermo Fisher ScientificMA535382
        兔抗TOLLIP抗体Proteintech11315-1-AP
        兔抗LC3B抗体Cell Signaling Technology3868S
        Western blot鼠抗β-actin抗体Cell Signaling Technology3700S
        兔抗β-actin抗体Cell Signaling Technology8457S
        鼠抗α-tubulin抗体Cell Signaling Technology3873S
        兔抗ITCH抗体Proteintech20920-1-AP
        兔抗NEDD4L抗体Proteintech13690-1-AP
        兔抗NDFIP1抗体Proteintech15602-1-AP
        兔抗WWP2抗体Proteintech12197-1-AP
        兔抗NEDD4抗体Proteintech21698-1-AP
        兔抗NDFIP2抗体ProteintechPA5-52657
        鼠抗VCP抗体Santa Cruz Biotechnologysc-57492
        兔抗HDAC6抗体Cell Signaling Technology7558T
        鼠抗SQSTM1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-48402
        细胞培养DMEM培养基Gibco11995065
        胎牛血清Gibco10437028
        青霉素-链霉素Gibco15070063
        潮霉素BGibco10687010
        稳定细胞系构建pOG44质粒InvitrogenV600520
        FuGENE HD转染试剂PromegaE2311
        邻近标记无酚红FluoroBrite DMEMGibcoA1896701
        M2光反应器Acceled--
        蛋白质组学样品制备Pierce链霉亲和素磁珠Thermo Fisher Scientific88816
        RIPA裂解液Thermo Fisher Scientific89901
        BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23227
        质谱级胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific90057
        免疫荧光Hoechst 33342核染料Tocris Bioscience5117
        链霉亲和素Alexa Fluor 555InvitrogenS21381
        CYTO-ID自噬检测试剂Enzo Life Sciences501031812
        Western blot4–15%梯度Criterion TGX预制胶Bio-Rad5671048
        0.45 μm硝酸纤维素膜Bio-Rad1620115
        siRNA敲低ON-TARGETplus SMART-pool ITCH siRNAHorizon DiscoveryL-007196-00-0005
        ON-TARGETplus SMART-pool NEDD4L siRNAHorizon DiscoveryL-007187-00-0005
        ON-TARGETplus SMART-pool NDFIP1 siRNAHorizon DiscoveryL-013419-01-0005
        ON-TARGETplus SMART-pool TOLLIP siRNAHorizon DiscoveryL-016930-00-0005
        RNAiMAX转染试剂Invitrogen13778-030
        TUBE pulldownK63特异性TUBE磁珠LifeSensorsUM404M-1000
        泛素TUBE磁珠LifeSensorsUM-0402M-1000
        活细胞成像HaloTag TMRDirect配体PromegaG2991

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        应激颗粒诱导与解聚
        NaAsO2浓度500 μM、处理30 min；解聚时间点D30、D60、D120；恢复期间每30 min换液
        阅读提示：Methods中SG formation and disassembly小节及Fig. 2a、b图注
        HaloMap邻近标记
        Ir配体5 μM孵育1 h；biotin–diazirine 500 μM孵育30 min；蓝光照射10 min；每个条件三个生物学重复
        阅读提示：Methods中Proximity labeling workflow小节及Fig. 1b图注
        泛素化抑制处理
        TAK-243 2 μM预孵育1 h并维持；heclin 25 μM预孵育1 h；不同加药时间窗口分组
        阅读提示：Methods中SG formation and disassembly小节及Fig. 2g、Fig. 3a图注
        siRNA敲低
        siRNA序列货号、转染试剂RNAiMAX、敲低后2天检测
        阅读提示：Methods中siRNA KD小节及Fig. 4c、Fig. 5a图注
        自噬调控处理
        BafA1 100 nM预孵育3 h；Torin 1 250 nM预孵育9 h；TAT-D11 10 μM预孵育9 h
        阅读提示：Methods中SG formation and disassembly小节及Fig. 6d、e、f图注

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