光亲和探针合成与细胞活性验证
确认探针保留母体化合物的细胞毒性和线粒体定位，以用于靶点鉴定。
在C9 2-脱氧葡萄糖位点引入双吖丙啶和炔基合成Apop A-PA等探针，在MV-4-11细胞中用MTT评估细胞毒性，在H292细胞中经UV交联后用罗丹明叠氮标记并进行共聚焦显微成像。
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Apoptolidin家族糖大环内酯通过抑制ATP合酶靶向白血病
Apoptolidin family glycomacrolides target leukemia through inhibition of ATP synthase.
实验完整度
高含光亲和标记鉴定靶点、冷冻电镜结构解析、深度突变扫描与CRISPR验证、小鼠异种移植体内药效等多层证据
主要模型
MV-4-11急性髓系白血病细胞系 K562白血病细胞系 HRas-G12V转化BaF3细胞 NSGS小鼠MV-4-11异种移植模型
重点核对
光亲和探针Apop A-PA在MV-4-11细胞中标记约50 kDa靶点，表观EC50约10 nM，可被过量Apop A和Ammo A竞争，而不被oligomycin竞争 TMT定量蛋白质组学鉴定竞争条件下唯一高度富集蛋白为ATP5B，免疫印迹证实其特异性富集 冷冻电镜解析Ammo A和Apop A结合酵母ATP合酶结构，分辨率分别为3.1和3.4 Å，抑制剂仅结合于αDPβDP界面 深度突变扫描筛选21个结合位点残基的420个点突变，鉴定ATP5B-I390和ATP5C-L77为抗性热点 CRISPR/Cas9引入ATP5B-I390R或ATP5C-L77R赋予对Apop A和Ammo A完全抗性并消除Apop A-PA结合 NSGS小鼠MV-4-11异种移植中Ammo A 0.1 mg/kg每日腹腔给药（5天给药2天停药，共2周）显著降低骨髓白血病负荷
摘要
癌细胞早已被认识到具有独特的生物能量学需求。Apoptolidin家族糖大环内酯因其对癌基因转化细胞的选择性细胞毒性而著称，但其分子机制仍不明确。我们使用apoptolidin的光亲和类似物鉴定出线粒体ATP合酶的F1亚复合体是apoptolidin A的靶点。apoptolidin和ammocidin与ATP合酶复合物的冷冻电镜结构揭示了一种新的共同抑制模式，该模式经结合界面的深度突变扫描证实，发现了抗性突变，并用CRISPR-Cas9进行了验证。Ammocidin A在可耐受且毒性极低的剂量下可抑制体内白血病进展。细胞、结构、突变和体内证据的结合明确了apoptolidin家族糖大环内酯的作用机制，并为应对OXPHOS依赖性癌症建立了路径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Apoptolidin家族糖大环内酯选择性杀伤癌基因转化细胞及白血病的分子靶点和作用机制是什么，能否在体内靶向OXPHOS依赖性癌症。
- 核心机制
- Apoptolidin家族糖大环内酯结合ATP合酶F1亚复合体αDPβDP界面的疏水口袋，迫使βDP亚基采取不利于核苷酸结合的开放构象并阻断旋转催化，从而抑制ATP合成与水解。
- 主要证据
- 光亲和探针标记与竞争实验、TMT定量蛋白质组学鉴定ATP5B、冷冻电镜结构解析、深度突变扫描与CRISPR/Cas9抗性突变验证，以及Ammo A在MV-4-11异种移植模型中的体内药效。
- 研究意义
- 明确了apoptolidin家族糖大环内酯的作用机制，并证明Ammo A在体内可生物利用、耐受良好且有效抑制白血病生长，为应对OXPHOS依赖性癌症及研究细胞OXPHOS依赖提供了路径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
光亲和标记与竞争实验鉴定靶蛋白
确定apoptolidin家族在细胞蛋白组中的特异性结合蛋白。
MV-4-11、K562、HRas-G12V BaF3和H292细胞经DMSO、Apop A-PA单独或与Apop A、Ammo A、Apop H、oligomycin竞争处理后光交联，经点击化学连接TAMRA-azide-desthiobiotin，进行凝胶荧光分析和亲和富集。
TMT定量蛋白质组学与免疫印迹确认靶点
无偏鉴定竞争条件下特异性富集的靶蛋白。
亲和富集样品经酶解和TMT六标标记后进行MudPIT LC-MS/MS，Limma分析差异富集蛋白；免疫印迹检测ATP5B、VDAC、TIMM17B和ATP5G1。
ATP合酶抑制的细胞与酶学功能验证
验证apoptolidin家族在细胞和纯化酶水平抑制ATP合酶活性。
在表达Perceval HR reporter的MV-4-11细胞中检测ADP/ATP比值；用PK/LDH偶联法测定纯化酵母ATP合酶和小鼠肝线粒体的ATPase及ATP合成活性，并进行抑制剂竞争和动力学分析。
冷冻电镜解析抑制剂结合位点与构象变化
确定糖大环内酯在ATP合酶上的结合位点及抑制的结构基础。
制备Ammo A结合、Apop A结合及无抑制剂酵母ATP合酶的冷冻电镜样品，收集数据、三维重构并构建原子模型，比较抑制剂结合前后的构象变化。
深度突变扫描与CRISPR/Cas9抗性验证
检验ATP合酶结合是否为细胞毒性所必需，并定位抗性突变。
基于结合位点4.5 Å内21个残基构建420个点突变文库，经Bxb1 landing pad系统整合入HEK-293T细胞，在半乳糖培养基中以Apop A或Ammo A两轮选择后深度测序；用CRISPR/Cas9 HDR在K562和MV-4-11中引入ATP5B-I390R、ATP5C-L77R等突变并检测药物敏感性和探针结合。
Ammo A体内药效与耐受性评价
评估ATP合酶抑制在体内是否具有治疗指数并能抑制白血病生长。
在NSGS小鼠中静脉移植MV-4-11细胞建立系统性异种移植模型，腹腔注射Ammo A，每周及终点用流式检测hCD45/hCD33阳性细胞，并进行骨髓hCD45免疫组化、药代和毒性评估。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
鉴定靶蛋白与蛋白质组分析
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 光亲和标记与竞争实验 | 探针浓度1 μM、竞争物Apop A 20 μM、UV 365 nm照射15 min、DMSO上限0.5%，以及竞争物种类（Apop A、Ammo A、Apop H、oligomycin） 阅读提示：Methods中Photoaffinity Labeling小节及Fig. 2a、Extended Data Fig. 1 |
| TMT定量蛋白质组学 | 探针与竞争条件、两个生物学重复、Limma分析阈值adjusted p-value 0.05及log2 fold change 2 阅读提示：Methods中TMT-Multiplexed Proteomics Sample Preparation与Statistical Analysis of TMT Proteomics小节及Fig. 2d |
| 冷冻电镜结构解析 | Ammo A 60 μM或Apop A 20 μM孵育1 h、各数据集颗粒数与最终分辨率（3.1、3.4、4.2 Å） 阅读提示：Methods中CryoEM Grid Preparation、CryoEM Data collection和Image analysis小节及Extended Data Fig. 4 |
| 深度突变扫描 | 21个残基选择标准（4.5 Å内）、420个点突变、半乳糖培养基强制OXPHOS依赖、两轮各4天药物暴露及剂量（Apop A 100 nM/1 μM，Ammo A 3/30/300 nM） 阅读提示：Methods中ATP Synthase Mutant Library Preparation与Mutant Library Transfection and Selection小节及Fig. 4a,b、Extended Data Fig. 6、7 |
| CRISPR/Cas9抗性突变验证 | 突变位点ATP5B-I390R、ATP5C-L77R、ATP5B-I390Y、ATP5B-L394F，细胞系K562、MV-4-11、HEK293LP，以及敏感性检测时间（48或72 h） 阅读提示：Methods中Generation and Validation of CRISPR lines小节及Fig. 4c、Extended Data Fig. 8 |
| 体内异种移植药效 | NSGS小鼠6–8周龄、100 cGy照射、每只1×10^6 MV-4-11细胞尾静脉注射、Ammo A 0.1或0.03 mg/kg腹腔注射5天给药2天停药共2周、每组n=5–7、第28天终点 阅读提示：Methods中In vivo Murine Modeling小节及Fig. 5a,b、Extended Data Fig. 9 |