鉴定YY1为候选G4结合蛋白
通过无偏定量蛋白质组学筛选G4结合蛋白。
使用SILAC定量蛋白质组学工作流，以生物素偶联的G4 DNA探针（来自KIT和MYC启动子及人端粒hTEL）及不能折叠成G4的突变序列（M4）进行pull-down，鉴定YY1为候选蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
YY1与鸟嘌呤四链体相互作用以调控DNA成环和基因表达
YY1 interacts with guanine quadruplexes to regulate DNA looping and gene expression.
实验完整度
高包含体外蛋白纯化与结合实验、细胞ChIP-Seq/HiChIP-Seq/RNA-Seq、CRISPR编辑及功能验证等多个证据层级
主要模型
HEK293T细胞系 重组人YY1蛋白 YY1-TAPTAG HEK293T细胞
重点核对
荧光各向异性测定重组YY1与G4/M4探针的结合亲和力（Kd值） ChIP-Seq分析YY1与G4位点的重叠及PDS/TMPyP4处理的影响 HiChIP-Seq/qPCR检测YY1介导的DNA成环及G4稳定配体或BLM过表达的影响 RNA-Seq及RT-qPCR验证YY1敲低或PDS/TMPyP4处理对基因表达的影响 使用YY1Δ231–290分离功能突变体验证二聚化在DNA成环中的作用
摘要
DNA鸟嘌呤四链体（G4）在DNA复制、转录和基因组稳定性维持等多种细胞过程中发挥重要作用。本研究表明，阴阳1（YY1）能够直接结合G4结构。ChIP-Seq结果显示，YY1结合位点与染色质中的G4结构位点广泛重叠。我们还观察到，YY1的二聚化及其与G4结构的结合有助于YY1介导的长距离DNA成环。将YY1从G4结构位点置换会显著破坏YY1介导的DNA成环。此外，使用G4稳定配体处理不仅调节启动子区含有G4结构的基因的表达，也调节那些与远端G4结构相关的基因的表达，这些远端G4结构通过YY1介导的DNA成环被拉近。总之，我们鉴定YY1为一种新的DNA G4结合蛋白，并揭示YY1介导的长距离DNA成环需要其二聚化，且部分通过其识别G4结构而发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YY1是否能够直接结合DNA G4结构，以及这种结合是否参与YY1介导的长距离DNA成环和基因表达调控。
- 核心机制
- YY1通过其C端锌指结构域直接结合G4结构；YY1二聚化使其能够同时结合两个G4结构或一个G4结构和一个共识基序双链DNA，从而促进DNA成环，进而调控启动子近端及远端基因的表达。
- 主要证据
- 荧光各向异性显示重组YY1与cKIT、cMYC和hTEL G4结构的Kd分别为26.7、26.3和82.0 nM；ChIP-Seq显示约39%的YY1峰与G4峰重叠；HiChIP-Seq显示PDS或TMPyP4处理使5–200 kb范围内YY1介导的DNA成环比例从35.6%降至9.4%和9.9%；RNA-Seq和RT-qPCR验证基因表达变化。
- 研究意义
- 揭示了YY1一种新的DNA识别模式（结合G4 DNA），并表明G4结构介导的基因调控不仅可通过启动子区G4结构，还可通过长距离DNA成环拉近的远端G4结构实现，为DNA成环和基因调控提供了新的分子决定因素。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证YY1与G4结构的直接结合及亲和力
确定YY1是否直接结合G4结构并测定结合亲和力。
纯化无标签重组人YY1蛋白，用荧光各向异性测定其与G4和M4探针的结合；用EMSA检测PDS或TMPyP4对YY1-G4结合的影响；用CD光谱评估YY1结合是否改变G4折叠。
确定YY1锌指结构域在G4结合中的作用
明确YY1哪些结构域参与G4结合及与双链DNA结合的竞争关系。
构建YY1截短体和突变体（YY11–382、YY1C360S、YY1231–414、YY1293–414），用荧光各向异性测定其对G4和M4的结合；用未标记G4或共识基序双链DNA进行竞争实验。
验证细胞内YY1与G4结构的结合
在细胞水平验证YY1与G4结构的相互作用及其可被G4稳定配体干扰。
用CRISPR-Cas9在HEK293T细胞YY1 C端敲入3×Flag-2×Strep标签，进行ChIP-Seq；与BG4 ChIP-Seq数据比较重叠；用PDS或TMPyP4处理细胞后进行ChIP-Seq和染色质分级-Western blot。
验证YY1-G4相互作用在YY1介导的DNA成环中的作用
确定YY1与G4结构的结合是否参与YY1介导的长距离DNA成环。
用HiChIP-Seq检测PDS或TMPyP4处理对YY1介导的DNA成环的影响；用BLM解旋酶过表达、CRISPR/Cas9突变内源性G4形成序列，结合HiChIP-qPCR验证。
验证YY1二聚化在DNA成环中的作用
确定YY1二聚化对G4结合及DNA成环功能的重要性。
用凝胶过滤色谱分析YY1及其截短体的寡聚状态；用EMSA测定YY1与G4 DNA的结合化学计量比；用邻近连接实验检测YY1促进DNA元件间连接的能力；构建YY1Δ231–290分离功能突变体，用ChIP-qPCR和HiChIP-qPCR检测其结合G4和促进DNA成环的能力。
验证YY1-G4结合对基因表达的调控
确定YY1-G4相互作用对启动子近端和远端基因表达的影响。
用RNA-Seq分析YY1敲低和/或PDS处理后的基因表达变化；用RT-qPCR验证代表性基因（MANF、PDHB、MYC、PGBD5、SLC25A28、TMEM145）以及通过长距离成环连接的远端基因（TRMT12、EHD3）的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白表达诱导 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Sigma | -- |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽超流琼脂糖 | Pierce | -- |
| 肝素柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 10/300色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白定量 | Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 荧光各向异性 | Horiba QuantaMaster-400荧光分光光度计 | Photon Technology International | -- |
| EMSA | Odyssey成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| CD光谱 | Jasco-815光谱仪 | Jasco | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- |
| 印迹级封闭剂 | Bio-Rad | -- | |
| ECL Western blot检测试剂 | Amersham | -- | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| YY1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7341 | |
| 抗兔IgG过氧化物酶抗体 | Sigma | A0545 | |
| 抗小鼠IgG HRP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-516102 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967S | |
| RT-qPCR | Omega总RNA试剂盒I | Omega | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | -- | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | -- | |
| CFX96 RT-qPCR检测系统 | Bio-rad | -- | |
| CRISPR-Cas9 | pX330质粒 | Addgene | -- |
| ChIP | 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 2368S |
| Protein A/G Plus琼脂糖 | Santa Cruz | -- | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ChIP-Seq | Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | -- |
| NEBNext Ultra™ DNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| NextSeq500测序系统 | Illumina | -- | |
| HiChIP | HindIII限制性内切酶 | NEB | -- |
| 链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | 65001 | |
| RNA-Seq | NEBNext® Ultra™ II RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | -- |
| NEBNext rRNA去除试剂盒 | NEB | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Illumina HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 染色质分级分离 | MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- |
| G4配体处理 | Pyridostatin | -- | -- |
| 5,10,15,20-四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 荧光各向异性结合实验 | DNA探针浓度10 nM、YY1蛋白浓度梯度、缓冲液含100 mM KCl和10 μM ZnCl、孵育30分钟冰上 阅读提示：Materials and Methods中Fluorescence Anisotropy小节 |
| ChIP-Seq | YY1-TAPTAG HEK293T细胞、PDS 20 μM或TMPyP4 5 μM处理12小时、anti-Flag抗体、超声破碎条件 阅读提示：Materials and Methods中ChIP-Seq小节及Figure 2图注 |
| HiChIP | 交联细胞数5×10^6、HindIII酶切、生物素标记、PDS 20 μM或TMPyP4 5 μM处理12小时 阅读提示：Materials and Methods中HiChIP-Seq和HiChIP-qPCR小节 |
| RNA-Seq | shRNA敲低YY1、PDS处理浓度和时间、两个生物学重复、rRNA去除 阅读提示：Materials and Methods中RNA-Seq and Data Analysis小节及Figure 5图注 |
| CRISPR-Cas9 G4位点突变 | guide序列针对内源性G4位点、供体质粒含突变G4序列、单克隆筛选和Sanger测序验证 阅读提示：Materials and Methods中Targeted Integration and Mutation with CRISPR-Cas9小节及Figure 4 |