建立NUDT15生化筛选体系并筛选先导化合物
从化合物库中鉴定能抑制NUDT15 dGTP水解活性的小分子起点。
采用酶偶联孔雀绿（MG）法，将重组人NUDT15、dGTP与大肠杆菌无机焦磷酸酶偶联，检测释放的无机磷酸；对17946个化合物在10 μM单浓度下筛选，命中化合物经三剂量复核，选出TH884并进行构效关系优化得到TH1760。
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开发针对NUDT15的化学探针
Development of a chemical probe against NUDT15.
实验完整度
高含生化筛选与SAR、共晶结构、DSF/CETSA/DARTS靶点结合、细胞活力及机制验证
主要模型
NB4和HL-60急性髓系白血病细胞系 HCT116及HCT116 3-6结直肠癌细胞 U2OS细胞裂解液与完整HCT116细胞 重组人NUDT15蛋白及共晶结构
重点核对
TH1760对dGTP水解的MG法IC50=25 nM，对6-thio-dGTP的IC50=57 nM TH1760在100 μM下对NUDIX家族及焦磷酸酶具选择性 TH1760使NUDT15熔解温度升高>10 °C，TH7285无此作用 CETSA中TH1760使细胞内NUDT15表观Tagg升高约6.5 °C TH1760与6-TG联用使EC50最大降低约10倍，敲低NUDT15后增效消失
摘要
NUDIX水解酶NUDT15最初被认为参与清除氧化核苷酸，但后来被发现可水解活性硫嘌呤代谢物6-thio-(d)GTP，从而决定该白血病及炎症疾病标准治疗药物的临床应答。然而，其生理作用仍不清楚。在此，我们致力于开发首个小分子NUDT15抑制剂以阐明其生物学功能，并可能用于改善依赖NUDT15的化疗。先导化合物TH1760通过直接、特异性地结合NUDT15催化口袋而表现出低纳摩尔生化活性，并在低微摩尔范围内与细胞内的NUDT15结合。我们进一步以硫嘌呤增效作为替代性功能读出，证明TH1760通过促进6-thio-(d)GTP在核酸中的积累而使细胞对6-硫代鸟嘌呤敏感。经生化验证的无活性结构类似物TH7285证实，硫嘌呤毒性增加是通过直接抑制NUDT15实现的。总之，TH1760代表了首个用于探究NUDT15生物学及潜在治疗途径的化学探针。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发首个强效、选择性小分子NUDT15抑制剂作为化学探针，以探究NUDT15生物学功能并可能改善依赖NUDT15的硫嘌呤化疗。
- 核心机制
- TH1760直接、特异性地结合NUDT15催化口袋并抑制其6-thio-(d)GTPase活性，减少6-thio-(d)GTP水解为6-thio-(d)GMP，从而促进6-thio-(d)GTP在核酸中积累并增强硫嘌呤毒性。
- 主要证据
- 生化MG及PPiLight assay显示TH1760纳摩尔级抑制；1.6 Å共晶结构揭示其结合模式；DSF、CETSA、DARTS证实细胞内外靶点结合；NB4、HL-60等细胞中TH1760以NUDT15依赖方式增强6-TG毒性，无活性类似物TH7285无效；放射性计数和质谱显示6-thio-(d)GTP积累增加，并伴随DNA损伤、G2期阻滞和凋亡。
- 研究意义
- TH1760是首个用于研究NUDT15生物学的化学探针，并可能作为精细调节硫嘌呤剂量或克服硫嘌呤耐药的治疗工具；其临床获益尚需进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TH1760的生化效价与选择性
确认TH1760对NUDT15的抑制强度及其对相关酶的选择性。
用MG法测定TH1760对dGTP水解的IC50，用PPiLight法测定对6-thio-dGTP水解的IC50；在100 μM下检测其对MTH1、NUDT2、NUDT5、NUDT9、NUDT12、NUDT14、NUDT18、NUDT22及dCTPase、dUTPase、ITPase的抑制；并用Eurofins Cerep SafetyScreen44 panel和44个激酶文库评估脱靶。
解析TH1760与NUDT15的共晶结构并开发无活性类似物
阐明TH1760的结合模式，并基于结构设计阴性对照化合物。
获得NUDT15-TH1760共晶结构（分辨率1.6 Å），比较其与6-thio-GMP的结合差异；基于苯并噁唑酮N-甲基化设计TH7285，并用MG法和DSF验证其失去抑制和稳定NUDT15的能力。
验证TH1760在细胞内的靶点结合
确认TH1760能在细胞内直接结合NUDT15。
在过表达HA标签NUDT15的HL-60细胞中进行CETSA，在NB4细胞或裂解液中进行ITDRF CETSA；在U2OS裂解液和完整HCT116细胞中进行DARTS，检测TH1760对NUDT15抗热变性或抗pronase消化的保护作用，并以TH884、TH7285及DMSO为对照。
建立硫嘌呤增效功能读出并验证NUDT15依赖性
以硫嘌呤增效作为NUDT15催化活性的细胞功能读出，并验证TH1760的效应依赖NUDT15。
用shRNA敲低NB4和HL-60细胞中的NUDT15，检测6-TG或6-MP的EC50变化；回补shRNA抗性的野生型、催化失活E67A或不稳定R139C NUDT15；再将TH1760与6-TG/6-MP剂量矩阵联用，用resazurin法测定细胞活力并计算协同分数；在NUDT15敲低细胞及TH7285处理中验证增效是否消失。
评估TH1760对耐药及肿瘤选择性模型的作用
探究TH1760能否在MMR缺陷或NT5C2突变等硫嘌呤耐药背景下恢复6-TG敏感性，并比较转化与非转化细胞。
在MMR缺陷HCT116及MMR恢复的HCT116 3-6细胞中行克隆形成实验；在携带NT5C2 R238W的697 B-ALL细胞中测定6-TG EC50；在BJ-hTERT与BJ-RAS等基因成对成纤维细胞中比较TH1760的6-TG增效作用。
检测6-thio-(d)GTP积累及下游细胞响应
从机制上确认TH1760通过增加6-thio-(d)GTP在核酸中的积累而增强硫嘌呤毒性。
HL-60细胞经DMSO或10 μM TH1760预处理1 h后加入14C标记6-MP或非标记6-TG，16–18 h后提取DNA/RNA，用放射性计数或LC-MS/MS检测6-thio-(d)GTP掺入；用碱性彗星实验检测DNA损伤，用Western blot检测γH2AX、CHK1/CHK2磷酸化、cleaved PARP和caspase 3，用流式检测细胞周期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | Phusion高保真PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BugBuster蛋白提取试剂 | Millipore | -- | |
| Benzonase核酸酶 | Merck-Millipore | 2.5 U/mL | |
| cOmplete Mini无EDTA蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| HisTrap柱 | GE Healthcare | -- | |
| MonoQ柱 | GE Healthcare | -- | |
| 酶活检测 | dGTP | Sigma Aldrich | D4010 |
| 大肠杆菌焦磷酸酶 | Sigma-Aldrich | I5907 | |
| PPiLight无机焦磷酸实验试剂盒 | Lonza | LT07-610 | |
| 6-硫代-dGTP | Jena Bioscience | NU-1213S | |
| 化合物筛选 | Echo 550声波液体处理仪 | LabCyte | -- |
| Labcyte 384 LDV板 | Labcyte | LP-0200 | |
| Labcyte 1536 HighBase板 | Labcyte | LP-03730 | |
| 384孔实验板 | Nunc | 242757 | |
| FlexDrop IV分液器 | PerkinElmer | -- | |
| Victor 3酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 靶点结合检测 | Sypro Orange荧光染料 | Thermo Fischer Scientific | -- |
| CFX96实时PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| cOmplete Mini蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Veriti 96孔热循环仪 | ABI | -- | |
| cOmplete Mini无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche, Merck | -- | |
| Western blot | UP100H超声处理器 | Hielscher | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| Trans-Blot Turbo转膜仪 | Bio-Rad | -- | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| Odyssey Fc成像仪 | Li-Cor | -- | |
| 抗NUDT15抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-84533 | |
| 抗SOD1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-11407 | |
| 抗磷酸化Chk1（Ser345）抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| 抗Chk1抗体 | Cell Signaling Technology | 2360 | |
| 抗磷酸化Chk2（Thr68）抗体 | Cell Signaling Technology | 2197 | |
| 抗Chk2抗体 | Cell Signaling Technology | 3440 | |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体 | Cell Signaling Technology | 2577 | |
| 抗cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9541 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2367 | |
| 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 抗β-Actin抗体 | Abcam | ab6276 | |
| 驴抗小鼠IgG IRDye 680RD二抗 | Li-Cor | 925–68072 | |
| 山羊抗兔IgG IRDye 800CW二抗 | Li-Cor | 925–32211 | |
| 细胞培养与药物处理 | 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 药物处理 | 6-硫代鸟嘌呤 | Sigma-Aldrich | -- |
| 巯嘌呤 | Merck AG | -- | |
| 细胞培养 | 含GlutaMAX的RPMI培养基 | ThermoFisher Scientific | -- |
| DMEM培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| McCoy’s 5A（改良）培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| MycoAlert支原体检测试剂 | Lonza | -- | |
| 慢病毒转染 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 新霉素（G418） | Sigma Aldrich | -- | |
| Gateway LR Clonase II酶混合物 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | 刃天青钠盐 | -- | -- |
| HidexSense酶标仪 | Hidex | -- | |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| Navios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| ATTO 488叠氮化物 | -- | -- | |
| 硫酸铜 | -- | -- | |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| 放射性检测 | 8-14C标记6-MP | Moravek Inc. | -- |
| E.Z.N.A.组织DNA提取试剂盒 | Omega | -- | |
| Direct-zol RNA小量制备试剂盒 | Zymo research | -- | |
| OptiPhase Supermix闪烁液 | Perkin Elmer | -- | |
| 1450 MicroBeta TriLux液闪计数仪 | -- | -- | |
| 质谱检测 | RNase A | Sigma-Aldrich | -- |
| 碱性磷酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DNase I | Roche Diagnostics | -- | |
| 核酸酶P1 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Benzonase核酸酶 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| LC-20AS高效液相色谱系统 | Shimadzu Corporation | -- | |
| API 5000三重四极杆质谱仪 | AB SCIEX | -- | |
| Triple Quad 5500质谱仪 | AB SCIEX | -- | |
| Primesep200混合模式色谱柱 | SieLC | -- | |
| Coresep100混合模式色谱柱 | SieLC | -- | |
| 彗星实验 | 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| Fisherfinest Premium Superfrost显微镜载玻片 | Thermo-Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Gold核酸凝胶染料 | ThermoFisher | -- | |
| Zeiss LSM 510共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 激酶选择性检测 | Real-Time PCR Mx3005p仪 | Stratagene | -- |
| RT-qPCR | Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Luminaris Color HiGreen qPCR预混液 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生化筛选与效价测定 | NUDT15浓度2 nM、dGTP 50 μM、化合物单浓度10 μM、缓冲液组成及22°C孵育20 min；PPiLight法6-thio-dGTP 2.5 μM 阅读提示：Online Methods中Malachite green assay与PPiLight inorganic pyrophosphate assay小节 |
| 细胞靶点结合CETSA | 细胞系HL-60/NB4、HA-NUDT15过表达、多西环素1 μg/mL诱导过夜、化合物浓度10或30 μM、加热温度及Tagg判定 阅读提示：Online Methods中Cellular thermal shift assay (CETSA)小节及Fig. 3a、Supplementary Fig. 4 |
| 细胞靶点结合DARTS | U2OS裂解液蛋白:pronase=25:1，HCT116为100–400:1，TH1760 10 μM，完整HCT116处理4 h，室温消化30 min 阅读提示：Online Methods中Drug affinity responsive target stability (DARTS)小节及Fig. 3b-c |
| 硫嘌呤增效细胞活力实验 | 细胞系、TH1760浓度矩阵、6-TG/6-MP浓度、处理4天、resazurin 10 μg/mL及544/590 nm检测、n=3重复 阅读提示：Online Methods中Cell viability assays小节及Fig. 5、Extended Data Fig. 4 |
| NUDT15敲低与回补 | shN15诱导条件、多西环素预处理48 h、WT/E67A/R139C回补构建体、6-TG处理时间 阅读提示：Online Methods中Cloning of mammalian lentiviral constructs与Cell viability assays小节及Fig. 4b-c、Fig. 5d |
| 6-thio-(d)GTP核酸掺入检测 | HL-60细胞、TH1760 10 μM预处理1 h、14C-6-MP 1或2 μM或非标记6-TG 0.5或1 μM、16–18 h后提取核酸、LC-MS/MS质量跃迁 阅读提示：Online Methods中Measurements of radioactive 6-MP in DNA and RNA与Mass Spectrometry-assisted measurement小节及Fig. 6a-b |
| DNA损伤与下游响应检测 | NB4/HL-60细胞、TH1760 10 μM、6-TG处理48 h、彗星实验每条件200细胞、Western blot检测γH2AX/CHK1/CHK2/PARP/caspase 3 阅读提示：Online Methods中Alkaline comet assay与Western blotting小节及Fig. 6c-d |