磺酰基-三唑探针设计与合成
开发可调离去基团的共价探针，用于酪氨酸标记。
合成含炔基报告标签的磺酰基-三唑探针HHS-465（1,2,3-三唑）和HHS-475（1,2,4-三唑），并通过NMR和X射线晶体学确认结构。
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利用硫-三唑交换化学全局靶向功能性酪氨酸
Global targeting of functional tyrosines using sulfur-triazole exchange chemistry.
实验完整度
高包含体外蛋白质组、活细胞、SILAC定量、突变验证及溶液反应等多层证据，并有功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞蛋白质组 活细胞（HEK293T、Jurkat、A549等） 重组野生型及酪氨酸突变体蛋白
重点核对
SuTEx探针浓度与处理时间：体外100 μM、1小时、25 °C；活细胞100 μM、2小时、37 °C SILAC标记：轻/重氨基酸标记HEK293T细胞，重标培养基含[13C615N4]L-精氨酸和[13C615N2]L-赖氨酸，培养6代 过钒酸盐激活条件：A549细胞100 μM处理30分钟，用于磷酸酪氨酸蛋白质组学 酪氨酸突变体验证：GSTP1 Y8F、EDC3 Y475F、PGAM1 Y92F、DPP3 Y417F LC-MS/MS数据过滤标准：Byonic评分≥300，前体质量误差<5 ppm
摘要
共价探针是全局研究蛋白质功能和配体结合能力的宝贵工具。尽管在扩大化学蛋白质组学可用残基（如半胱氨酸和赖氨酸）覆盖范围方面已做出努力，但蛋白质组的很大一部分仍无法用当前的活性探针触及。在此，我们介绍硫-三唑交换（SuTEx）化学作为一个可调平台，用于开发具有广泛化学蛋白质组学应用的共价探针。我们展示了对三唑离去基团的修饰可以产生磺酰基探针，其对酪氨酸相对于其他亲核氨基酸的化学选择性提高约5倍，从而首次在裂解液和活细胞中研究超过10,000个酪氨酸位点。我们发现具有增强亲核性的酪氨酸富集于酶、蛋白质-蛋白质相互作用和核苷酸识别结构域。我们将SuTEx作为化学磷酸蛋白质组学策略来监测磷酸酪氨酸位点的激活。总之，我们将SuTEx描述为一种用于人类蛋白质组化学生物学研究的生物相容性化学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发基于硫-三唑交换的可调共价探针，用于全局分析蛋白质组中酪氨酸的反应性、功能及翻译后修饰状态？
- 核心机制
- 磺酰基-三唑探针通过三唑离去基团与酪氨酸酚羟基发生硫-三唑交换反应，形成共价加合物；修饰三唑离去基团可调节探针对酪氨酸的化学选择性和反应活性。
- 主要证据
- 在HEK293T等多种细胞蛋白质组和活细胞中鉴定超过10,000个酪氨酸位点；SILAC定量发现约5%酪氨酸具有高亲核性；突变实验证实高反应性酪氨酸（如GSTP1 Tyr8）对探针标记和催化功能的关键作用；过钒酸盐激活结合定量蛋白质组学鉴定磷酸酪氨酸敏感位点。
- 研究意义
- SuTEx可作为生物相容的化学平台，用于人类蛋白质组的化学生物学研究，包括酪氨酸反应性分析、功能位点发现和化学磷酸蛋白质组学应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组中SuTEx探针标记与位点鉴定
评估SuTEx探针在复杂蛋白质组中的反应性和氨基酸选择性。
用HHS-465或HHS-475处理HEK293T等细胞蛋白质组，经铜催化叠氮-炔环加成连接脱硫生物素-叠氮标签，胰蛋白酶消化，亲和富集修饰肽段，LC-MS/MS鉴定修饰位点。
活细胞中酪氨酸标记评估
验证SuTEx探针的细胞通透性和在活细胞中的标记能力。
用HHS-465或HHS-475处理活细胞（HEK293T、Jurkat等），裂解后通过点击化学连接脱硫生物素或罗丹明-叠氮，进行LC-MS/MS或凝胶荧光分析。
酪氨酸亲核性定量（SILAC）
定量蛋白质组中酪氨酸的内在亲核性差异，鉴定高反应性酪氨酸。
将轻/重氨基酸标记的HEK293T蛋白质组分别用低浓度（25 μM）和高浓度（250 μM）HHS-465处理，混合后LC-MS/MS定量SILAC比值（SR）。
高反应性酪氨酸的功能验证
验证高反应性酪氨酸位点对探针标记和蛋白质功能的贡献。
在HEK293T细胞中过表达野生型或酪氨酸-to-苯丙氨酸突变体（GSTP1 Y8F、EDC3 Y475F、PGAM1 Y92F、DPP3 Y417F），用SuTEx探针标记并进行凝胶基化学蛋白质组学分析；GSTP1和DPP3突变体进行生化活性测定。
三唑离去基团优化以提高酪氨酸选择性
通过修饰三唑离去基团提高探针对酪氨酸的化学选择性。
合成系列1,2,4-三唑类似物（HHS-481、HHS-482、HHS-483等）及磺酰氟对照HHS-SF-1，在HEK293T蛋白质组中比较总修饰位点数及酪氨酸/赖氨酸（Y/K）比值。
溶液反应性及稳定性评估
评估三唑离去基团对磺酰基探针与酚类（酪氨酸模型）和胺类（赖氨酸模型）反应性的影响。
在四甲基胍（TMG）碱存在下，将磺酰基探针与对甲酚（p-cresol）或正丁胺（n-butylamine）孵育，通过HPLC监测探针消耗；并测试探针在DMSO和含水溶剂中的稳定性。
化学磷酸蛋白质组学应用
利用SuTEx探针标记竞争监测磷酸酪氨酸位点的变化。
用过钒酸盐激活A549细胞以抑制酪氨酸磷酸酶，裂解后以HHS-475或HHS-482标记，结合SILAC定量比较vehicle（轻标）与过钒酸盐（重标）处理组中酪氨酸位点的探针标记差异；并通过Western blot验证特定位点的磷酸化变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质组标记与检测
定量蛋白质组学
溶液反应性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Omega Scientific | -- |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | -- | |
| SILAC细胞培养 | [13C615N4]L-精氨酸 | -- | -- |
| [13C615N2]L-赖氨酸 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1-GSTP1-FLAG质粒 | GenScript | -- |
| pcDNA3.1-DPP3-FLAG质粒 | GenScript | -- | |
| pcDNA3.1-PGAM1-FLAG质粒 | GenScript | -- | |
| pcDNA3.1-EDC3-FLAG质粒 | GenScript | -- | |
| 过钒酸盐激活 | 原钒酸钠 | New England BioLabs | P0758S |
| 过氧化氢（30%水溶液） | -- | -- | |
| 细胞裂解 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片 | Thermo Scientific | A32959 |
| NP40细胞裂解液 | Invitrogen | FNN0021 | |
| Western blot | 生物素化P-Tyr-100抗体 | Cell Signaling Technology | 9417S |
| 磷酸化PKM (Y105)兔抗体 | Cell Signaling Technology | 3827S | |
| PKM兔抗体 | Cell Signaling Technology | 3198S | |
| 磷酸化STAT3 (Y705)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9145S | |
| STAT3小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9139S | |
| 磷酸化Catenin δ−1 (Tyr228)兔抗体 | Cell Signaling Technology | 2911 | |
| Catenin δ−1兔抗体 | Cell Signaling Technology | 4989 | |
| GAPDH兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| DyLight 550标记山羊抗兔IgG | Thermo Scientific | 84541 | |
| DyLight 650标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | 84545 | |
| DyLight 550标记链霉亲和素 | Thermo Scientific | 84542 | |
| 凝胶基化学蛋白质组学 | 罗丹明-叠氮 | -- | -- |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺 | -- | -- | |
| 硫酸铜 | -- | -- | |
| LC-MS/MS样品制备 | 脱硫生物素-PEG3-叠氮 | -- | -- |
| 胰蛋白酶/Lys-C | Promega | -- | |
| LC-MS/MS分析 | Ultimate 3000 RSLC纳升系统 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| HPLC分析 | Shimadzu 1100系列光谱仪 | Shimadzu | -- |
| Phenomenex Kinetex C18色谱柱（2.6 μm，50 mm x 4.6 mm） | Phenomenex | -- | |
| GSTP1生化活性测定 | BMG Labtech CLARIOstar酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| DPP3生化活性测定 | Arg-Arg β-萘酰胺三盐酸盐 | Sigma-Aldrich | -- |
| BMG Labtech CLARIOstar酶标仪 | BMG Labtech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组标记 | 探针浓度、处理时间、温度；文中报告100 μM、1小时、25 °C（体外蛋白质组） 阅读提示：Online Methods中“Preparation of proteomes for LC-MS/MS analysis”及图1图注 |
| 活细胞标记 | 探针浓度、处理时间、温度；文中报告100 μM、2小时、37 °C 阅读提示：Online Methods中“Live cell evaluation of sulfonyl-triazole probes”及补充图9、10 |
| SILAC定量 | 重标氨基酸种类和浓度、标记代数；文中报告[13C615N4]L-精氨酸和[13C615N2]L-赖氨酸各100 μg/mL，培养6代 阅读提示：Online Methods中“SILAC cell culture”及“Preparation of SILAC proteomes for LC-MS/MS analysis” |
| 过钒酸盐激活 | 过钒酸盐浓度、处理时间；文中报告100 μM、30分钟 阅读提示：Online Methods中“Pervanadate Activation”及图6图注 |
| LC-MS/MS数据过滤 | Byonic评分阈值和前体质量误差；文中报告评分≥300、质量误差<5 ppm（除非另有说明） 阅读提示：Online Methods中“LC-MS/MS data analysis” |