PARP1降解剂的设计与合成
设计并合成基于Rucaparib和CRBN配体pomalidomide的PROTAC分子，优化连接子、弹头和E3连接酶配体。
将Rucaparib通过不同连接子与pomalidomide或VHL配体偶联，合成一系列化合物，并评估其降解PARP1的能力。
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选择性PARP1降解实现PARP1捕获与抑制的解偶联
Uncoupling of PARP1 trapping and inhibition using selective PARP1 degradation.
实验完整度
高包含体外酶活、细胞模型（HeLa、C2C12、原代心肌细胞）、蛋白质组学、染色质分离、激光微辐照、动物原代细胞等多层验证。
主要模型
HeLa细胞 C2C12肌母细胞及肌管 原代大鼠新生心肌细胞
重点核对
iRucaparib浓度梯度处理原代心肌细胞24小时，Western blot检测PARP1降解，DC50为36 nM（AP5）和82 nM（AP6）。 iRucaparib（1 μM）预处理24小时后，MMS（0.01%）处理2小时，染色质结合蛋白免疫印迹检测PARP1捕获。 Rucaparib或iRucaparib（10 μM）处理HeLa细胞48小时，免疫荧光检测γH2AX焦点。 过氧亚硝酸盐（500 μM）处理C2C12肌管2小时或原代心肌细胞30分钟，检测NAD+水平。 过氧亚硝酸盐（500 μM）处理C2C12肌管8小时或（100 μM）原代心肌细胞30分钟，CellTiter-Glo检测ATP水平。
摘要
PARP1抑制剂（PARPi）通过两种机制杀死肿瘤细胞：PARP1催化抑制和PARP1捕获。然而，这两种途径在介导PARPi细胞毒性中的相对贡献尚不完全清楚。在此，我们设计了一系列小分子PARP降解剂。其中一种化合物iRucaparib的处理导致高效且特异的PARP1降解。iRucaparib在体外抑制PARP1的酶活性，并在完整细胞中抑制PARP1介导的PAR化信号。该策略模拟PARP1基因缺失，使得PARP1抑制与PARP1捕获在药理学上得以解偶联。最后，通过降解PARP1，iRucaparib保护肌肉细胞和原代心肌细胞免受DNA损伤诱导的能量危机和细胞死亡。总之，这些化合物代表了“非捕获型”PARP1降解剂，同时阻断PARP1的催化活性和支架效应，为改善PARP1过度激活引起的各种病理状况提供了理想的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PARP1抑制剂通过催化抑制和PARP1捕获两种机制杀伤肿瘤细胞，但两者在细胞毒性中的相对贡献尚不清楚，且缺乏药理学工具来解偶联这两种途径。
- 核心机制
- iRucaparib作为PROTAC型PARP1降解剂，通过CRBN E3连接酶诱导PARP1泛素化和蛋白酶体降解，从而同时消除PARP1的催化活性和支架功能，避免PARP1捕获。
- 主要证据
- 在HeLa细胞、C2C12肌管和原代心肌细胞中，iRucaparib高效降解PARP1（DC50分别为36 nM和82 nM），抑制PAR化信号，减少染色质结合的PARP1，且不诱导γH2AX或细胞周期阻滞；定量蛋白质组学显示其特异性降解PARP1；在过氧亚硝酸盐或MMS处理下，iRucaparib保护细胞免于NAD+和ATP耗竭及细胞死亡。
- 研究意义
- PARP1降解剂提供了一种药理学手段来解偶联PARP1抑制与捕获，有助于解析PARP1抑制剂细胞毒性机制，并可能用于改善PARP1过度激活相关的病理状况，如缺血再灌注损伤和神经退行性疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PARP1降解活性评估
在细胞中验证化合物对PARP1的降解效果，确定DC50和Dmax，并验证降解机制依赖于CRBN和蛋白酶体。
用不同浓度的化合物处理原代大鼠新生心肌细胞24小时，Western blot检测PARP1蛋白水平；使用MG132、Rucaparib、pomalidomide阻断实验，以及CRBN敲除细胞验证机制。
降解特异性评估
通过定量蛋白质组学评估iRucaparib对PARP1降解的特异性。
使用TMT标记的定量质谱分析原代心肌细胞经DMSO、iRucaparib-AP5或iRucaparib处理后的全蛋白质组变化。
PAR化信号抑制评估
验证iRucaparib在体外和细胞内抑制PARP1催化活性和PAR化信号的能力。
使用PARP1/2化学发光活性试剂盒测定IC50；用SILAC标记的HeLa细胞，经PDD00017273和Rucaparib或iRucaparib处理，H2O2诱导PAR化，富集ADP-核糖化肽段并进行质谱分析。
PARP1捕获与催化抑制的解偶联
比较Rucaparib和iRucaparib对PARP1染色质捕获的影响，明确降解剂不引起捕获。
HeLa细胞经Rucaparib或iRucaparib预处理24小时，MMS处理2小时，亚细胞分离提取染色质结合蛋白，免疫印迹检测PARP1；同时用GFP-PARP1激光微辐照观察PARP1募集动力学；定量质谱分析染色质结合蛋白质组。
细胞毒性及DNA损伤反应评估
确定PARP1捕获在Rucaparib细胞毒性中的作用。
HeLa细胞经Rucaparib或iRucaparib处理，检测γH2AX焦点、细胞周期和细胞增殖。
保护细胞免于基因毒性应激诱导的死亡
验证iRucaparib模拟PARP1基因缺失，保护细胞免于DNA损伤诱导的能量危机和死亡。
在C2C12肌管和原代心肌细胞中，用Rucaparib或iRucaparib预处理，然后暴露于MMS、H2O2或过氧亚硝酸盐，检测PARP1捕获、γH2AX、NAD+和ATP水平以及细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | 奥拉帕尼 | LC laboratory | -- |
| BMN-673 | Selleck | -- | |
| 维利帕尼 | Selleck | -- | |
| 尼拉帕尼 | Selleck | -- | |
| 鲁卡帕尼 | Selleck | -- | |
| MG-132 | Selleck | -- | |
| 泊马度胺 | Selleck | -- | |
| PDD 00017273 | Tocris | -- | |
| 过氧亚硝酸盐 | Cayman Chemical | -- | |
| 抗体 | GAPDH抗体 | Thermo | -- |
| 聚ADP核糖抗体 | Trevigen | -- | |
| PARP1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| SP1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| H3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| γH2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| CRBN抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| VHL抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488偶联抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| FluorSave封片剂 | Millipore | 345789 | |
| 质粒 | 慢病毒CRISPR质粒 | Addgene | 52961 |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Sigma | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 马血清 | Sigma | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 免疫印迹 | SDS裂解液 | Sigma | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫沉淀 | Triton X-100裂解液 | Sigma | -- |
| 蛋白G琼脂糖珠 | Sigma | -- | |
| 质谱 | TMT六标试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Lys-C蛋白酶 | Wako | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Oasis HLB固相萃取柱 | Waters | -- | |
| ZORBAX 300 Extend-C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| Orbitrap Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-nLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PARP活性检测 | PARP通用化学发光检测试剂盒 | Trevigen | 4676-096-K |
| PARP2化学发光检测试剂盒 | BPS Bioscience | 80552 | |
| Synergy酶标仪 | Bio-Tek | -- | |
| 亚细胞分离 | 亚细胞分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 78840 |
| 激光微辐照 | Zeiss LSM 780倒置共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| MicroPoint激光照明和烧蚀系统 | Photonic Instruments, Inc. | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| NAD+检测 | NAD/NADH定量试剂盒 | Sigma | -- |
| RNA提取与qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| SuperScript III第一链合成试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | ABI | -- | |
| CFX实时定量PCR系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iRucaparib诱导PARP1降解 | 细胞类型（原代大鼠新生心肌细胞）、iRucaparib浓度梯度、处理时间24小时、DC50值（AP5为36 nM，AP6为82 nM） 阅读提示：Methods中Cell Culture和Calculation of DC50小节，Figure 2A和2D |
| PARP1捕获实验 | 细胞类型（HeLa、C2C12肌管、原代心肌细胞）、Rucaparib或iRucaparib浓度（1 μM）、预处理时间（24小时）、MMS浓度（0.01%）和处理时间（2小时） 阅读提示：Methods中Subcellular Protein Extraction小节，Figure 5A和Figure 6A-6B |
| DNA损伤反应（γH2AX）检测 | 细胞类型（HeLa、C2C12肌管、原代心肌细胞）、药物浓度（10 μM）、处理时间（48小时）、抗体稀释比例（1:200） 阅读提示：Methods中Immunofluorescence Microscopy小节，Figure 5C和Figure 6C-6D |
| NAD+和ATP水平检测 | 细胞类型（C2C12肌管、原代心肌细胞）、预处理浓度（1 μM）和时间（24小时）、过氧亚硝酸盐浓度（500 μM或100 μM）和处理时间（2小时或30分钟/8小时）、检测试剂盒 阅读提示：Methods中ATP and NAD+ measurement小节，Figure 6E-6F |
| 定量蛋白质组学 | 细胞类型（原代心肌细胞、HeLa）、TMT标记方案、生物学重复数（2）、质谱平台（Orbitrap Elite） 阅读提示：Methods中Quantitative Mass Spectrometry小节，Figure 3和Supplementary Figure 6 |