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        Jumonji-C氧酶JMJD7催化TRAFAC GTPases的(3S)-赖氨酸羟化

        The Jumonji-C oxygenase JMJD7 catalyzes (3S)-lysyl hydroxylation of TRAFAC GTPases.

        作者信息Suzana Markolovic, Qinqin Zhuang, Sarah E Wilkins, Charlotte D Eaton, Martine I Abboud, Maximiliano J Katz, Helen E McNeil, Robert K Leśniak, Charlotte Hall, Weston B Struwe, Rebecca Konietzny, Simon Davis, Ming Yang, Wei Ge, Justin L P Benesch, Benedikt M Kessler, Peter J Ratcliffe, Matthew E Cockman, Roman Fischer, Pablo Wappner, Rasheduzzaman Chowdhury, Mathew L Coleman, Christopher J Schofield
        PMID29915238
        期刊Nat Chem Biol
        发布时间2018-07
        DOI10.1038/s41589-018-0071-y
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        结合果蝇RNAi表型、细胞互作与定位、重组蛋白酶活、晶体结构、质谱及氨基酸分析等多层证据

        主要模型

        果蝇后翅隔室RNAi模型 HEK293T细胞 HeLa细胞 重组人JMJD7蛋白

        重点核对

        JMJD7野生型与H178A突变体的活性依赖性互作比较 DRG1 K22/DRG2 K21为羟化位点，K22A/K21A突变阻断羟化与互作 MALDI-MS反应依赖Fe(II)、2OG，并被NOG抑制 氨基酸分析与标准品比对确认(3S)-羟基赖氨酸产物 JMJD7敲低降低纯化DRG2对poly-C琼脂糖的结合

        摘要

        生化、结构和细胞研究揭示，含Jumonji-C（JmjC）结构域的蛋白7（JMJD7）是一种2-酮戊二酸（2OG）依赖性氧酶，催化一种此前未报道的翻译后修饰类型——(3S)-赖氨酸羟化。晶体学分析显示，JMJD7与JmjC羟化酶的关系比与JmjC去甲基化酶更近。生物物理和突变研究表明，JMJD7具有独特的二聚化模式，单体间相互作用涉及N端和C端区域以及二硫键形成。蛋白质组学方法鉴定出翻译因子（TRAFAC）GTPase家族中两个相关成员——发育调控GTP结合蛋白1和2（DRG1/2）——为活性依赖的JMJD7相互作用蛋白。质谱分析证明，JMJD7催化DRG1/2中一个高度保守赖氨酸残基的Fe(II)和2OG依赖性羟化；氨基酸分析揭示JMJD7催化(3S)-赖氨酸羟化。JMJD7的功能鉴定将使未来研究能够确定DRG羟化在细胞生长和疾病中的作用。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        JMJD7的催化活性、底物及其催化的翻译后修饰类型尚不明确，本研究旨在对其进行生化与功能鉴定。
        核心机制
        JMJD7作为Fe(II)/2OG依赖性JmjC羟化酶，催化DRG1 K22和DRG2 K21位点(3S)-赖氨酸羟化，该修饰促进DRG与RNA的结合。
        主要证据
        晶体结构显示JMJD7类似JmjC羟化酶；质谱与MALDI-MS鉴定DRG1/2羟化位点及(3S)-羟基赖氨酸产物；JMJD7敲低降低DRG2的RNA结合；果蝇RNAi显示敲低增加后翅隔室大小。
        研究意义
        首次报道人类(3S)-赖氨酸羟化这一翻译后修饰，为研究DRG羟化在细胞生长和疾病中的作用奠定基础。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        果蝇JMJD7同源基因敲低表型分析

        探究JMJD7同源基因对细胞与组织生长的影响

        在后翅隔室RNAi筛选中敲低CG10133，测量后翅隔室面积及翅毛密度以评估细胞大小

        2

        JMJD7重组蛋白表达与体外活性检测

        确认JMJD7为Fe(II)/2OG依赖性氧酶

        大肠杆菌表达His6-JMJD7，1H NMR监测2OG向琥珀酸转化，并检测H178A与NOG影响

        3

        JMJD7晶体结构解析

        明确JMJD7结构与JmjC羟化酶/去甲基化酶的关系

        解析全长His6-JMJD7与Mn(II)、2OG复合物及R260C变体晶体结构，分析二聚化界面与活性位点

        4

        蛋白质组学鉴定JMJD7相互作用蛋白

        寻找JMJD7的潜在底物

        在DMOG处理细胞中比较野生型与H178A JMJD7的免疫亲和纯化产物，质谱鉴定差异互作蛋白

        5

        验证JMJD7与DRG/DFRP互作及共定位

        确认DRG1/2为活性依赖的JMJD7互作蛋白

        FLAG免疫沉淀与Western blot、内源DFRP复合物共沉淀、HeLa免疫荧光共定位

        6

        鉴定并验证DRG赖氨酸羟化位点

        确定JMJD7催化DRG羟化的位点与序列要求

        纯化HA-DRG/V5-DFRP进行质谱，合成DRG1/2肽段用MALDI-MS检测+16 Da Shift，检测K22A/K21A突变及辅因子依赖性

        7

        确定羟化位点区域与立体化学

        明确JMJD7催化(3S)-赖氨酸羟化

        对羟化DRG1/2肽段进行酶解、AQC衍生化LC-MS，与C3/C4/C5羟基赖氨酸标准品及(2S,3R)/(2R,3S)标准品比对，并用NMR分析

        8

        评估羟化对DRG稳定性、GTPase活性及RNA结合的影响

        探究(3S)-赖氨酸羟化的生物学功能

        检测DRG蛋白表达、热稳定性、GTP酶活性及poly-C琼脂糖结合，比较JMJD7敲低与羟化位点突变

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        果蝇RNAi敲低翅成像与面积测量翅毛密度计数
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹免疫荧光免疫共沉淀SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳尺寸排阻色谱镍亲和色谱
        验证机制链路
        基质辅助激光解吸电离质谱液相色谱-质谱联用氨基酸分析氢核磁共振波谱18O2掺入实验定点突变X射线晶体学分子置换非变性质谱尺寸排阻色谱-多角度光散射圆二色光谱
        验证免疫效应
        免疫亲和纯化非标记定量蛋白质组学
        验证细胞功能变化
        RNA pull-down实验GTP酶活性检测孔雀石绿磷酸释放实验差示扫描量热法shRNA敲低

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基----
        胎牛血清Sigma--
        青霉素-链霉素----
        质粒转染FuGENE6转染试剂Promega--
        siRNA转染OligoFectamine转染试剂ThermoFisher--
        Sigma MISSION siRNA寡核苷酸Sigma--
        稳定细胞系构建pMD2.G质粒----
        psPAX2质粒----
        pZIP-TRE3G shERWOOD Ultramir载体库Transomic--
        Western blot抗HA标签抗体（克隆16B12）BioLegend--
        抗DRG1抗体Proteintech13190-1-AP
        抗DRG2抗体Proteintech14743-1-AP
        抗JMJD7抗体St Johns LaboratorySTJ29545
        抗JMJD4抗体Ximbio152745
        抗DFRP1抗体SIGMAHPA031099
        抗DFRP2抗体GeneTexGTX120331
        抗β-肌动蛋白抗体Abcamab8227
        抗FLAG抗体SIGMAA8592
        抗V5抗体BioRadMCA1360P
        免疫荧光Alexa Fluor 555抗小鼠二抗ThermoFisher--
        Alexa Fluor 488抗兔二抗ThermoFisher--
        DAPI染料Sigma--
        ProLong Gold抗淬灭封片剂NEB--
        蛋白提取Complete蛋白酶抑制剂Roche--
        蛋白定量Pierce 660nm蛋白定量试剂----
        Western blotSuperSignal West Pico化学发光底物Thermo Fisher Scientific--
        SuperSignal West Dura化学发光底物Thermo Fisher Scientific--
        SuperSignal West Femto化学发光底物Thermo Fisher Scientific--
        底物捕获多西环素SIGMA--
        二甲基-N-草酰甘氨酸（DMOG）SIGMAD3695
        免疫沉淀N-草酰甘氨酸（NOG）Cambridge Bioscience13944
        抗FLAG M2磁珠SigmaM8823
        免疫沉淀洗脱3x-FLAG肽SIGMAF4799
        内源复合物免疫沉淀蛋白A琼脂糖Millipore--
        DRG纯化抗HA琼脂糖珠SIGMAA2095
        DRG纯化洗脱抗HA肽SIGMAI2149
        RNA结合实验多聚胞苷酸-琼脂糖珠SIGMAP9827
        多聚尿苷酸-琼脂糖珠SIGMAP8563
        对照蛋白A琼脂糖珠Millipore16-156
        质谱前处理PepMAP C18色谱柱----
        质谱检测Q-Exactive质谱仪Thermo--
        Q-Exactive HF质谱仪Thermo--
        Orbitrap Fusion Lumos质谱仪Thermo--
        体外翻译TNT快速偶联转录/翻译系统PromegaL1170
        质谱前处理抗FLAG M2磁珠Sigmam8823
        重组蛋白表达大肠杆菌Rosetta (DE3)pLysSNovagen--
        重组蛋白诱导异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）----
        蛋白纯化AKTA快速蛋白液相色谱系统GE Healthcare--
        Superdex 75 10/300 GL色谱柱Amersham Pharmacia Biosciences--
        HiTrap镍柱----
        羟化反应六水合硫酸亚铁铵----
        2-酮戊二酸二钠盐（2OG）----
        (+)-L-抗坏血酸钠----
        羟化确认Xevo GS-2-S质谱仪Waters--
        浓度测定ND-1000分光光度计Nanodrop Technologies--
        肽合成Liberty Blue自动微波肽合成仪CEM Corporation--
        Multipep RSi固相肽合成仪Intavis AG Bioanalytical Instruments--
        Tentagel S-RAM树脂----
        肽纯化Vydac C18色谱柱----
        NMR活性检测重水Sigma-Aldrich--
        氘代Tris D-11Cambridge Isotope Laboratories--
        Bruker Avance III 700 MHz波谱仪Bruker--
        MALDI-MSα-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）----
        Waters 96孔MALDI靶板Waters--
        Waters Micromass MALDI micro MX质谱仪Waters--
        18O2掺入实验18O2气体CK Isotopes--
        质量流量控制器Brooks Instruments--
        非变性质谱Thermo QExactive质谱仪Thermo--
        Waters Synapt G2Si质谱仪Waters--
        Bio-spin 6离心柱Bio-Rad--
        SEC-MALSAgilent 1260高效液相色谱仪Agilent--
        Superdex 200 Increase 3.2/300尺寸排阻色谱柱GE Healthcare--
        DAWN HELEOS II散射检测器Wyatt Technologies--
        Optilab T-rEX示差折光检测器Wyatt Technologies--
        圆二色光谱Chirascan圆二色光谱仪Applied Photophysics--
        肽NMRSep Pak C18柱----
        Bruker AVIII 700 MHz核磁共振波谱仪Bruker--
        3 mm MATCH核磁管Cortecnet--
        氨基酸分析灰色链霉菌非特异性蛋白酶Sigma-Aldrich--
        Waters Acquity超高效液相色谱系统Waters--
        Xevo G2-S QTof质谱仪Waters--
        差示扫描量热VP毛细管差示扫描量热仪Malvern--
        GDPSigma--
        GTP酶活性检测孔雀石绿试剂（磷酸盐检测试剂盒，比色法）Abcam--
        PheraStar酶标仪----
        GTPase-Glo试剂盒PromegaV7681
        Bruker AVIII 600 MHz核磁共振波谱仪Bruker--
        晶体学氯化锰----
        乙酸钠----

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        果蝇生长表型
        CG10133 RNAi品系、en-Gal4驱动、4日龄果蝇及后翅隔室面积测量方式
        阅读提示：Online Methods 'Analysis of growth phenotypes in Drosophila melanogaster'及Supplementary Fig. 2
        JMJD7酶活与底物捕获
        多西环素诱导时间38小时、DMOG 1 mM处理16小时、NOG 1 mM及H178A对照
        阅读提示：Online Methods 'JMJD7 proteomic screen'与'JMJD7:DRG interaction assays'及Fig. 2a
        DRG羟化位点鉴定与验证
        DRG1 K22/DRG2 K21位点、K22A/K21A突变、肽段浓度50 µM、JMJD7 10 µM、Fe(II) 100 µM、2OG 200 µM、37°C反应时间
        阅读提示：Online Methods 'MALDI-MS hydroxylation assays'与'Co-factor/substrate dependence assays'及Fig. 3b-d
        羟化立体化学分析
        AQC衍生化、m/z 503.2提取离子色谱、C3/C4/C5羟基赖氨酸标准品及(2S,3R)/(2R,3S)标准品
        阅读提示：Online Methods 'Amino acid analyses'及Fig. 4a-b、Supplementary Fig. 19
        RNA结合实验
        JMJD7 shRNA敲低72小时、4 mg poly-C琼脂糖、4°C 2小时、n=3生物学独立实验及统计方法
        阅读提示：Online Methods 'RNA interaction assays'及Fig. 4d、Supplementary Fig. 22
        晶体结构解析
        蛋白浓度25/26 mg/mL、MnCl2 2 mM、2OG 4 mM、沉淀剂1.5 M硝酸钠pH 4.6、R260C变体添加剂组成
        阅读提示：Online Methods 'Crystallization conditions'与'Data collection, structure solution, and refinement'及Supplementary Table 1

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