组蛋白分离与ADPr位点鉴定
从细胞中分离组蛋白并鉴定内源性ADPr位点。
硫酸提取结合SP-Sepharose色谱纯化组蛋白，部分FASP消化，UHPLC-MS/MS分析，ETD碎裂定位修饰位点。
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丝氨酸是组蛋白内源性ADP-核糖基化的新靶残基
Serine is a new target residue for endogenous ADP-ribosylation on histones.
实验完整度
高体外细胞模型、质谱鉴定、SILAC定量、抑制剂实验及体外酶学验证多层级证据
主要模型
人U2OS骨肉瘤细胞 HEK293T细胞 鸡DT40细胞 商业HeLa核心组蛋白
重点核对
U2OS细胞经2 mM H2O2处理10分钟诱导DNA损伤，并以未处理细胞为对照 SILAC标记：轻标L-赖氨酸（#L8662, Sigma-Aldrich），重标13C6,15N2-L-赖氨酸（#608041, Sigma-Aldrich），标记效率>99% 部分FASP消化：胰蛋白酶与蛋白比例1:2000，20°C消化20分钟 olaparib预处理浓度2 μM，处理40分钟 ETD碎裂结合HCD诊断离子触发采集高分辨率MS/MS谱
摘要
ADP-核糖基化（ADPr）是一种在生物学和临床上重要的翻译后修饰，但对其在细胞蛋白上靶向的氨基酸知之甚少。本文提出一种蛋白质组学策略，用于直接体内鉴定和定量组蛋白上的ADPr位点。我们在人骨肉瘤细胞中鉴定了12个独特的ADPr位点，并报道丝氨酸ADPr是一种响应DNA损伤的新型组蛋白标记。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞蛋白上ADP-核糖基化靶向哪些氨基酸残基，特别是组蛋白上的ADPr位点及其对DNA损伤的响应。
- 核心机制
- 组蛋白丝氨酸残基的ADP-核糖基化是一种新型组蛋白标记，其水平在DNA损伤后显著升高，且该修饰是酶促的。
- 主要证据
- 利用部分FASP结合ETD质谱在人骨肉瘤细胞中鉴定12个独特ADPr位点，其中10个定位到丝氨酸；SILAC定量显示H2O2处理10分钟后ADPr标记增加10-27倍；olaparib抑制DNA损伤诱导的丝氨酸ADPr。
- 研究意义
- 首次提供蛋白质通过丝氨酸羟基与ADP-核糖连接的直接证据，将丝氨酸ADPr确立为新型组蛋白标记，为研究ADPr在细胞功能中的作用提供新方向和工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ADPr位点响应DNA损伤的定量分析
验证新鉴定的丝氨酸ADPr位点是否响应DNA损伤。
SILAC标记U2OS细胞，H2O2处理10分钟，混合轻/重裂解液，纯化组蛋白，LC-MS/MS定量ADPr标记变化。
验证ADPr的酶促性质
检验DNA损伤诱导的丝氨酸ADPr是否为酶促修饰。
用PARP抑制剂olaparib预处理细胞，再诱导DNA损伤，检测ADPr水平变化。
排除纯化方法偏倚
确认丝氨酸ADPr的鉴定不是由于酸提取或消化pH偏倚所致。
分析无酸提取的HeLa组蛋白和抗FLAG纯化组蛋白，降低消化pH至7.3，并进行体外ADPr反应检测其他氨基酸。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| SILAC标记 | L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L8662 |
| 13C6,15N2-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | 608041 | |
| 组蛋白纯化 | 磺丙基-Sepharose树脂 | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Vivacon 500离心浓缩器 | Sartorius Stedim | -- | |
| SILAC实验 | 奥拉帕尼 | Cayman Chemical | 10621 |
| 免疫印迹 | 抗聚ADP-核糖多克隆抗体 | Trevigen | 4336-BPC-100 |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）单克隆抗体 | Merck Millipore | 05-636-I | |
| 抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3（Ser28）多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9713 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3.3（Ser31）单克隆抗体 | Abcam | ab92628 | |
| 抗GAPDH单克隆抗体 | Calbiochem | CB1001 | |
| PAR稳定性分析 | 聚ADP-核糖标准品 | Enzo Biochem, Inc | ALX-202-043-C001 |
| PARP1活性实验 | PARP1 | Trevigen | 4668 |
| 活化DNA | Trevigen | 4671-096-06 | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Trevigen | 4684-096-02 | |
| 体外ADP-核糖基化 | GST-PARP10cd | -- | -- |
| 细胞裂解 | ADP-HPD | Calbiochem | 118415 |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶Gold | Promega | -- |
| Vivacon® 500平板过滤器 | Sartorius Stedim | -- | |
| LC-MS/MS | EASY-nLC 1000液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion仪器 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组蛋白纯化 | 硫酸提取浓度0.1 M，4°C 2小时；PCA沉淀终浓度4% v/v；SP-Sepharose色谱洗脱条件 阅读提示：Online Methods中Histone purification小节 |
| 部分FASP消化 | 胰蛋白酶与蛋白比例1:2000，20°C消化20分钟；终止条件pH<3 阅读提示：Online Methods中Protein digestion小节及Figure 1a图注 |
| SILAC标记与DNA损伤处理 | SILAC标记需>7代，标记效率>99%；H2O2浓度2 mM处理10分钟；olaparib预处理2 μM 40分钟 阅读提示：Online Methods中Cell culture and SILAC labeling及SILAC experiments小节，Figure 3a图注 |
| 质谱数据采集与位点定位 | ETD碎裂参数：分辨率30,000，最大注射时间1000 ms，AGC 500,000；HCD诊断离子触发条件 阅读提示：Online Methods中ETD acquisitions小节 |
| 数据分析与位点验证标准 | MaxQuant版本1.5.0.30；Andromeda得分≥100，质量偏差<3 ppm，定位得分>0.9；手动验证碎片离子覆盖 阅读提示：Online Methods中Data analysis小节 |