筛选仅保留单一活性的SIRT6突变体
寻找只保留三种催化活性之一的SIRT6突变体
在大肠杆菌中纯化SIRT6 WT、S56Y、G60A、R65A、H133Y，用H3K9豆蔻酰肽、H3K9乙酰肽及染色质组分检测去脂肪酰基、去乙酰化及ADP-核糖基化活性
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
解析SIRT6去脂肪酰基酶活性的功能贡献
Identifying the functional contribution of the defatty-acylase activity of SIRT6.
实验完整度
高含大肠杆菌与HEK293T纯化蛋白体外酶活、动力学、NAD+结合、细胞CRISPR敲除回补、SILAC蛋白组及外泌体功能验证
主要模型
Sirt6敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） HEK 293T SIRT6敲除细胞 大肠杆菌BL21(DE3)纯化SIRT6蛋白 NIH 3T3细胞
重点核对
SIRT6 G60A对H3K9豆蔻酰肽的去脂肪酰基活性约为WT的50%，对H3K9乙酰肽无可检测去乙酰化活性 G60A对NAD+的Kd为564±84 µM，加入脂肪酰肽后Km,NAD+降至47±9 µM Sirt6 KO MEF回补G60A可降低TNFα赖氨酸脂肪酰化并促进其分泌 SILAC中以SILAC3（H133Y）H/L比值0.8–1.25作为质控筛选分泌蛋白 G60A回补抑制RPL17和RPS7经外泌体分泌
摘要
哺乳动物sirtuin 6（SIRT6）表现出许多关键功能和多种酶活性，但每种活性对各功能的具体贡献尚不清楚。我们鉴定出一个SIRT6 G60A突变体，该突变体具有高效的去脂肪酰基酶活性，但在体外去乙酰化酶活性显著降低，在细胞中检测不到去乙酰化酶活性。G60A突变体与NAD+的结合能力下降，但脂肪酰基赖氨酸肽的存在可恢复NAD+结合，这解释了其去脂肪酰基酶活性的保留。利用该突变体，我们发现SIRT6的去脂肪酰基酶活性调控众多蛋白质的分泌。有趣的是，许多核糖体蛋白通过外泌体从Sirt6敲除小鼠胚胎成纤维细胞中分泌，且与对照外泌体相比，这些外泌体促进了NIH 3T3细胞增殖。我们的数据支持SIRT6的不同活性调控不同通路，且G60A突变体是研究去脂肪酰基酶活性对SIRT6各种功能贡献的有用工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SIRT6的去乙酰化、去脂肪酰基化和ADP-核糖基化三种酶活性各自对SIRT6不同生物学功能有何贡献。
- 核心机制
- G60A突变改变活性位点构象并显著降低NAD+结合，但脂肪酰基肽可恢复构象与NAD+结合，使该突变体保留去脂肪酰基活性而缺失细胞内去乙酰化活性；SIRT6去脂肪酰基活性调控多种蛋白分泌。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白酶活与动力学、NAD+荧光结合及热位移实验；HEK293T与MEF细胞回补实验检测H3K9/H3K56乙酰化和TNFα脂肪酰化；SILAC鉴定分泌蛋白；外泌体分离与NIH 3T3增殖实验。
- 研究意义
- 表明SIRT6不同酶活性调控不同通路，G60A突变体可作为剖析去脂肪酰基活性对SIRT6多种功能贡献的工具，并拓展了去脂肪酰基活性在蛋白分泌中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
酶动力学与NAD+结合机制分析
定量比较WT与G60A催化效率并解释活性差异原因
测定H3K9豆蔻酰和乙酰肽动力学参数，用色氨酸荧光和10 kDa超滤法测定NAD+结合，并进行热位移和荧光光谱分析
细胞内活性验证
确认G60A在细胞中仅保留去脂肪酰基活性
在HEK293T SIRT6 KO细胞中回补WT或突变体检测H3K9/H3K56乙酰化；在Sirt6 KO MEF中转染TNFα并用Alk14标记检测脂肪酰化
功能归属分析：分泌与转录
判断去脂肪酰基活性对TNFα分泌和基因转录调控的贡献
检测TNFα分泌；检测IAP2、GLS、RPL3、MnSOD mRNA水平；检测葡萄糖饥饿敏感性
SILAC鉴定SIRT6调控的分泌蛋白
系统鉴定受SIRT6不同活性调控的分泌蛋白
收集无血清培养12 h的分泌蛋白，进行SILAC1–3实验并按H/L比值分组
外泌体介导的核糖体蛋白分泌及功能验证
验证核糖体蛋白是否经外泌体分泌并影响细胞增殖
分离微囊泡与外泌体，Western blot检测RPL17和RPS7；用等量外泌体处理NIH 3T3细胞检测增殖
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫沉淀 | 抗Flag亲和凝胶 | Sigma | A2220 |
| Western blot | 辣根过氧化物酶偶联抗Flag抗体 | Sigma | A8592 |
| 人/鼠SIRT6抗体 | Cell Signaling Technology | 12486 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 组蛋白H3K9乙酰化抗体 | Cell Signaling Technology | 9671 | |
| 组蛋白H3K56乙酰化抗体 | Cell Signaling Technology | 4243 | |
| RanGAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 14675 | |
| Ran抗体 | Cell Signaling Technology | 4462 | |
| 膜联蛋白A1抗体 | Cell Signaling Technology | 8691 | |
| 腱生蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 12221 | |
| VCP抗体 | Cell Signaling Technology | 2649 | |
| HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4877 | |
| 钠钾ATP酶抗体 | Cell Signaling Technology | 3010 | |
| 核纤层蛋白A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-4777 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 | |
| COL5A1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20648 | |
| COL6A1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20649 | |
| RPL17抗体 | Proteintech | 14121-1-AP | |
| RPS7抗体 | Proteintech | 14491-1-AP | |
| CXCL1抗体 | Thermo Fisher | PA1-29220 | |
| 细胞处理 | 布雷菲德菌素A | Sigma | -- |
| 酶活反应 | 棕榈酸 | Sigma | -- |
| 蛋白纯化洗脱 | 3X FLAG肽 | Sigma | -- |
| 蛋白裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- |
| SILAC | [13C6, 15N2]-L-赖氨酸 | Sigma | -- |
| [13C6, 15N4]-L-精氨酸 | Sigma | -- | |
| 蛋白质酶解 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 细胞转染 | FuGene 6转染试剂 | Promega | -- |
| Western blot | ECL plus蛋白质印迹检测试剂 | Thermo Scientific Pierce | -- |
| 细胞裂解 | 细胞裂解通用核酸酶 | Thermo Scientific Pierce | -- |
| 肽段脱盐 | Sep-Pak C18柱 | Waters | -- |
| 蛋白浓缩与缓冲液置换 | Amicon Ultra ultracel-10膜离心过滤单元 | EMD Millipore | -- |
| HPLC分析 | Kinetex 5u EVO C18 100A色谱柱 | Phenomenex | -- |
| 荧光检测 | Typhoon 9400可变模式成像仪 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 质谱分析 | LTQ-Orbitrap Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 逆转录 | SuperScript III第一链合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| PCR扩增 | Herculase II Fusion酶与dNTP组合试剂盒 | Agilent | -- |
| 实时PCR | iTaq通用SYBR Green预混液 | Biorad | -- |
| 实时PCR检测 | LightCycle 480 II系统 | Roche | -- |
| 荧光光谱分析 | Cary Eclipse荧光分光光度计 | Agilent | -- |
| 共聚焦成像 | Zeiss LSM880共聚焦/多光子显微镜 | Zeiss | LSM880 |
| ELISA | 人TNFα ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外去脂肪酰基与去乙酰化酶活反应 | SIRT6浓度（1 µM去脂肪酰基、4 µM去乙酰化无棕榈酸、2 µM加棕榈酸）、肽浓度25 µM、NAD+ 1 mM、棕榈酸300 µM、反应时间20 min/4 h/2 h 阅读提示：Methods中SIRT6 deacylase activity assay小节及Figure 1a、1b图注 |
| NAD+结合亲和力测定 | SIRT6 3 µM、NAD+浓度范围（WT与S56Y为0–500 µM，G60A与R65A为0–5 mM）、乙酰肽1 mM、豆蔻酰肽0.1 mM 阅读提示：Methods中Intrinsic tryptophan fluorescence小节及Supplementary Table 2 |
| 细胞回补实验 | Sirt6 KO MEF及HEK293T SIRT6 KO细胞背景、慢病毒载体pCDH、嘌呤霉素1.5 mg/mL筛选、Flag标签pCMV-Tag 4a 阅读提示：Methods中Stable overexpression小节与Cloning, expression and purification from HEK 293T cells小节 |
| TNFα脂肪酰化检测 | TNFα转染后18 h、Alk14 50 µM与brefeldin A 4 µg/mL处理6 h、点击化学试剂用量 阅读提示：Methods中Detection of lysine fatty-acylation on TNFα by in-gel fluorescence小节及Figure 3b图注 |
| SILAC分泌蛋白组 | 重标培养5代、每对样品40 µg混合、SILAC1–3设计、H/L阈值>1.5或<0.667、SILAC3质控0.8–1.25 阅读提示：Methods中SILAC小节与Figure 4b、4c图注 |
| 外泌体分离与增殖实验 | 差速离心参数（500 g 5 min、3,000 g 20 min、100,000 g 2 h）、0.2 µm过滤、NTA定量、等量外泌体处理NIH 3T3 阅读提示：Methods中Isolation of microvesicles and exosomes小节及Figure 6c图注 |