计算与生物物理验证H₂S与HDAC6催化锌的结合
验证HS⁻能否进入CD2活性位点隧道并与催化Zn²⁺形成配位。
经典MD模拟HS⁻扩散进入CD2隧道；量子化学计算S–Zn键级、电荷分解与能量扫描；SPR检测NaHS与hHDAC6-CD1-2结合；ICP-MS检测锌剥离后锌含量；DSF和CD检测构象变化。
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硫化氢结合HDAC6的催化锌并调节一种替代性脱乙酰化途径
Hydrogen sulfide engages catalytic zinc in HDAC6 to modulate an alternative deacetylation pathway.
实验完整度
高含MD/量子化学计算、SPR/ICP-MS蛋白生化、冷冻电镜结构、细胞迁移/成管、乙酰化组学及Hdac6-/-小鼠血管生成验证
主要模型
重组人HDAC6蛋白及CD1/CD2活性位点突变体 HUVEC与EA.hy926内皮细胞（HDAC6敲低/敲除及回补） 293T细胞（HDAC6敲除） Hdac6-/-小鼠后肢缺血与Matrigel plug模型
重点核对
NaHS浓度梯度（0.023–600 μM）SPR结合及12 μM活性峰值、>120 μM抑制 锌剥离（10 mM DDTC+20 mM EDTA）后ICP-MS锌含量与SPR结合丢失 CD2活性位点突变体H611A/Y782F与CD1突变体H216A的脱乙酰酶活性差异 60 μM NaHS处理HUVEC的α-tubulin乙酰化及HDAC6敲低后的迁移/成管表型 NaHS 30 μmol/kg/d处理Hdac6-/-小鼠14天后肢血流灌注比
摘要
硫化氢（H₂S）是一种气体递质，其对蛋白质功能的非共价效应仍未完全阐明。在此，我们表明H₂S衍生的硫物种结合组蛋白脱乙酰酶6（HDAC6）的催化Zn²⁺中心，并在特定条件下增强脱乙酰酶活性。分子动力学模拟支持HS⁻进入CD2活性位点隧道，而表面等离子体共振和锌耗竭实验支持可逆的、锌依赖性的结合。量子化学计算支持一条化学上可行的硫相关脱乙酰化途径，该途径生成硫代乙酸，我们在无细胞反应、培养细胞、小鼠组织和人血清中检测到硫代乙酸。冷冻电镜定义了人HDAC6催化域的串联组织，并揭示了CD1和CD2不同的隧道结构。HDAC6缺失减弱H₂S诱导的内皮迁移和血管生成，且CD2是这些反应所必需的。这些发现支持HDAC6作为一种H₂S响应性Zn²⁺依赖性脱乙酰酶，并将锌-硫配位与改变的脱乙酰化化学联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- H₂S衍生的硫物种能否结合人HDAC6的催化Zn²⁺中心，并通过非经典机制调节其脱乙酰化活性及HDAC6依赖的细胞功能？
- 核心机制
- H₂S衍生的硫物种（S²⁻）在HDAC6 CD2活性位点取代水/氢氧化物作为亲核体，攻击乙酰基羰基碳，生成硫代乙酸而非乙酸，硫代乙酸随后可水解为乙酸并再生H₂S，形成替代性脱乙酰化循环。
- 主要证据
- MD模拟显示HS⁻进入CD2隧道；SPR显示NaHS可逆结合且锌剥离后消失；量子化学计算支持Zn–S配位及S²⁻介导途径；UHPLC-QQQ-MS在无细胞反应、细胞、小鼠肝脏和人血清中检测到硫代乙酸；HDAC6敲低/敲除及CD2突变体阻断H₂S促内皮迁移和成管；Hdac6-/-小鼠中H₂S促血管生成效应减弱。
- 研究意义
- 提出HDAC6作为H₂S响应性Zn²⁺依赖性脱乙酰酶，将锌-硫配位与改变的脱乙酰化化学及内皮迁移/血管生成联系起来，拓展了超越经典共价翻译后修饰的蛋白质调控概念。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外脱乙酰酶活性及突变体分析
确定H₂S对HDAC6活性的影响及CD1/CD2活性位点的贡献。
使用α-tubulin来源荧光底物测定hHDAC6-WT及H216A、H611A、Y782F、H216/611A突变体活性；NaHS剂量响应；稳态动力学；SIRT2对照；缓冲液置换验证可逆性。
检测硫代乙酸生成与代谢
验证替代脱乙酰化途径的含硫产物及其在细胞和体内的存在与周转。
无细胞HDAC6反应体系中UHPLC-QQQ-MS检测硫代乙酸；WT与HDAC6-KO 293T细胞、小鼠组织及人血清检测；NaHS处理；硫代乙酸脉冲-追踪实验。
冷冻电镜解析hHDAC6-CD1-2串联结构
提供CD1与CD2活性位点隧道差异的结构框架。
重组hHDAC6-CD1-2（A84-R835）冷冻电镜单颗粒分析，3.86 Å分辨率，模型搭建与精修。
内皮细胞功能与乙酰化组学验证
验证HDAC6 CD2在H₂S促内皮迁移、成管及乙酰化网络中的作用。
HUVEC划痕和Transwell迁移、Matrigel成管；HDAC6敲低或敲除及CD1/CD2突变体回补；α-tubulin乙酰化Western blot；乙酰化组学比较NaHS、CSE-KO和HDAC6-KO。
体内血管生成验证
验证HDAC6在H₂S促血管生成中的作用。
WT与Hdac6-/-小鼠Matrigel plug实验及后肢缺血模型，NaHS腹腔注射，激光多普勒血流检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | 1052 | |
| SMM293-TII培养基 | Sino Biological | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 转染与敲低 | pLKO.1载体 | -- | -- |
| 基因敲除 | LentiCRISPRv2载体 | -- | -- |
| Transwell迁移实验 | 8.0 μm孔径聚碳酸酯膜Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 成管实验 | 生长因子减少型基质胶 | Sigma Merk | -- |
| Western blot | 抗HDAC6抗体 | Cell Signaling Technology | 7612 |
| 抗HDAC6抗体 | Cell Signaling Technology | 7558 | |
| 抗乙酰化α-tubulin抗体 | Abcam | ab24610 | |
| 抗α-tubulin抗体 | Abcam | ab52866 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 抗p62抗体 | Proteintech | 66184-1-Ig | |
| 抗LC3B抗体 | Abcam | ab192890 | |
| 抗Beclin-1抗体 | Abcam | ab207612 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗CSE抗体 | Abcam | ab189916 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP | Abcam | ab205719 | |
| 山羊抗兔IgG HRP | Abcam | ab205718 | |
| 免疫荧光 | FITC标记鬼笔环肽 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | F432 |
| 抗cortactin抗体 | Abcam | ab81208 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG F(ab′)₂ | Cell Signaling Technology | 4412 | |
| Alexa Fluor 488标记抗小鼠IgG F(ab′)₂ | Cell Signaling Technology | 4408 | |
| Alexa Fluor 594标记抗小鼠IgG F(ab′)₂ | Cell Signaling Technology | 8890 | |
| 乙酰化组学 | PTMScan乙酰赖氨酸基序试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 脱乙酰酶活性测定 | Fluor de Lys脱乙酰化标准品 | Enzo Life Sciences | -- |
| 锌剥离 | 二乙基二硫代氨基甲酸钠 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | Cytiva | -- |
| SPR | CM5传感芯片 | GE Healthcare | -- |
| Biacore T200表面等离子体共振仪 | GE Healthcare | -- | |
| ICP-MS | PE NexION 1000 G电感耦合等离子体质谱仪 | -- | -- |
| 圆二色光谱 | JASCO J-1500圆二色光谱仪 | JASCO | -- |
| DSF | SYPRO Orange染料 | -- | -- |
| 罗氏LightCycler 480 II实时PCR仪 | Roche | -- | |
| 冷冻电镜 | Vitrobot Mark IV冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| R1.2/1.3金/铜多孔碳膜载网 | Quantifoil Inc | -- | |
| Titan Krios电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Falcon IV直接电子探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UHPLC–QQQ–MS | Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent 6490 A三重四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞H₂S检测 | 单溴二胺 | -- | -- |
| 蛋白表达 | 293F细胞 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | R79007 |
| 人脐静脉内皮细胞 | ScienCell Research Laboratories | 8000 | |
| 293T细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| EA.hy926内皮细胞 | ATCC | CRL-2922 | |
| 蛋白纯化 | HiTrap脱盐柱 | GE Healthcare | -- |
| 乙酰化组学 | Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| μPAC Neo高通量色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Sep-PAK固相萃取柱 | Waters | -- | |
| C18吸头 | Thermo Scientific | -- | |
| 激光多普勒 | MoorLDI2-2l激光多普勒成像系统 | Moor Instruments | -- |
| 荧光检测 | SpectraMax i3x酶标仪 | Molecular Device | -- |
| 免疫荧光成像 | LSM 710共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| H₂S与HDAC6结合（SPR） | NaHS浓度系列0.012–600 μM、流速30 μl/min、25°C、CM5芯片胺偶联固定25 μg/ml hHDAC6-CD1-2、TSA阳性对照0.0008–2 μM 阅读提示：Methods 'Surface plasmon resonance assay'及Fig. 2a–g图注 |
| 锌剥离与活性检测 | 锌剥离条件10 mM DDTC+20 mM EDTA、4°C过夜；脱乙酰酶活性测定底物浓度与反应时间 阅读提示：Methods 'ICP-MS analysis of zinc content'与'Deacetylase activity assay'；Fig. 2e–g |
| NaHS剂量响应与突变体活性 | NaHS 6–60 μM增强、>120 μM抑制；12 μM用于稳态动力学；CD1/CD2突变体H216A、H611A、Y782F、H216/611A 阅读提示：Results 'H2S-induced increase in catalytic activity'与Fig. 3b–g；Supplementary Table 1–2 |
| 硫代乙酸检测 | 无细胞反应12 μM NaHS；细胞60 μM NaHS；小鼠30 μmol/kg/d；UHPLC–QQQ–MS MRM m/z 134.07→100.1与134.07→75.1；LOD 0.00865 μM、LOQ 0.0262 μM 阅读提示：Methods 'Thioacetic acid measurement assay'；Fig. 3h–l |
| 内皮细胞迁移与成管 | NaHS 60 μM；HUVEC shHDAC6敲低效率74–85%；Transwell 8.0 μm孔径、12 h迁移；成管16 h；划痕0 h与24 h 阅读提示：Methods 'The wound healing assay'、'The transwell assay'、'Tube formation assay'；Fig. 6b–e |
| 小鼠后肢缺血与Matrigel plug | C57BL/6J雌/雄8–10周龄；NaHS 30 μmol/kg/d腹腔注射7天（Matrigel）或14天（缺血）；激光多普勒0、7、14天；各组样本量 阅读提示：Methods 'Angiogenesis in vivo: Matrigel plug assay'与'Murine hindlimb ischemia model'；Fig. 6l–m |