3D球体形成与药物处理
建立均一的3D球体模型并进行药物扰动。
在384孔ULA板中接种HCT116或HT29细胞，离心促进球体形成，24小时后加入药物库化合物处理48小时。
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3D球体中的Cell Painting高内涵形态学分析
High-content morphological profiling by Cell Painting in 3D spheroids.
实验完整度
高包含2D/3D细胞培养、3D球体成像、单细胞分析、EdU/γH2AX验证及bulk RNA-seq，多层次功能与机制验证。
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系 HT29结直肠癌细胞系 3D球体培养模型
重点核对
HCT116和HT29球体分别以270和300个细胞/孔接种于384孔ULA板，24小时形成球体后药物处理48小时 52种药物设4个浓度（10、3、1、0.3 µM），每条件4个重复，每板20个DMSO对照 3D Cell Painting采用18小时染色和72小时果糖-甘油透明化 成像使用Nikon ECLIPSE Ti2-E转盘共聚焦，30×总放大，12个光学层，间距5 µm EdU/γH2AX实验：5-FU 10 µM、奥拉帕利3 µM、依托泊苷2.5 µM处理48小时，EdU脉冲5 µM 2小时
摘要
Cell Painting是一种广泛应用的高内涵成像检测方法，可在规模上捕获2D细胞培养物的形状和内部组织。虽然3D细胞培养物是更接近生理相关性的模型——尤其是在研究药物扰动时——但由于光在到达培养物内部之前会发生散射，对其进行成像仍然具有挑战性。在此，我们介绍一种可扩展的方法，将Cell Painting适配于3D球体。我们表明，组织透明化——一种使球体透明的技术——与一种在飞行中定位球体的聚焦程序相结合，能够在完整球体内实现单细胞水平的Cell Painting。通过分析52种临床相关药物，我们表明单细胞指纹按生物通路聚类，并且比扁平化球体整体视图更稳健地解析药物效应。值得注意的是，两种药物5-氟尿嘧啶和奥拉帕利在2D单层中几乎无法区分，但在球体中出现了分歧。这一发现随后通过DNA损伤、细胞周期和基因表达检测得到了证实。该工作流程在标准384孔板格式的转盘共聚焦显微镜上运行，使已经进行Cell Painting的实验室能够使用单细胞3D分析。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否将Cell Painting适配于3D球体，并在单细胞水平上解析药物诱导的形态学变化，比较2D与3D培养格式下的药物响应差异。
- 核心机制
- 5-FU和奥拉帕利通过不同机制影响DNA复制：奥拉帕利作为PARP抑制剂引起更多DNA损伤（γH2AX），而5-FU更强地抑制S期进入并激活p53/p21程序；3D培养格式改变了这些应激信号整合为p53/p21响应的方式，导致两种药物在3D中形态学分歧。
- 主要证据
- 在HCT116和HT29球体中进行3D Cell Painting，单细胞聚合特征比MIP投影更稳健地聚类药物；5-FU与奥拉帕利在2D中形态相似但在3D中分歧，经EdU、γH2AX免疫染色和bulk RNA-seq证实。
- 研究意义
- 建立了一个在3D球体中进行单细胞图像表型探索的框架，使单细胞3D分析能够在标准高内涵筛选设备上进行，并可用于2D难以捕捉的培养模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
3D Cell Painting染色与透明化
使染料渗透球体并实现单细胞水平成像。
固定、透化、染料孵育18小时，然后用果糖-甘油溶液透明化72小时。
转盘共聚焦成像与球体检测
在3D球体内获取单细胞分辨的多通道图像。
使用自定义on-the-fly聚焦算法定位球体，在30×下采集12个光学层，每层5 µm间距。
图像分割与特征提取
从单细胞中提取形态学特征并进行标准化。
使用Cellpose分割细胞和细胞核，CellProfiler提取>2000个形态学特征，按切片标准化后聚合。
单细胞与MIP特征比较及药物聚类
评估单细胞聚合特征是否比球体整体投影更好地解析药物效应。
计算grit分数、重复相关性、UMAP和层次聚类，比较scAgg与MIP特征。
2D与3D药物响应比较
比较相同药物在2D单层和3D球体中的形态学响应差异。
用相同52种药物处理2D贴壁细胞，进行标准Cell Painting，计算余弦相似性并比较2D与3D的差异。
DNA损伤、细胞周期和基因表达验证
验证5-FU与奥拉帕利在3D球体中的分歧机制。
EdU/γH2AX免疫染色和bulk RNA-seq分析5-FU、奥拉帕利和对照处理的球体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 31870 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| GlutaMax | Gibco | A1286001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Gibco | 15400054 | |
| 支原体检测 | Lonza支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-418 |
| 药物处理 | AMG-232 | Sigma | TA9H93ED7611 |
| 5Z-7-氧代玉米赤霉烯醇 | Sigma | O9890 | |
| 依托泊苷 | Sigma | E1383 | |
| 芬苯达唑 | Sigma | F5396 | |
| 星形孢菌素 | Sigma | 19-123 | |
| D-山梨醇 | Sigma | S1876 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2438 | |
| 药物点样 | Corning 384孔微板 | Corning | CLS 3656 |
| I.DOT | Dispendix | -- | |
| I.DOT PURE S Plate 100 | Dispendix | D16110021800 | |
| 2D细胞培养 | PhenoPlate 384孔微板 | Revvity | 6057302 |
| 3D球体培养 | 384孔ULA球体微板 | Corning | 3830 |
| 细胞接种 | ViaFlo 384 | Integra | -- |
| Cell Painting洗涤与分液 | Biotek 405 LS | Biotek | -- |
| Biotek MultiFlo FX | Biotek | -- | |
| Cell Painting洗涤 | 1× PBS | Gibco | 18912014 |
| Cell Painting透化 | Triton X-100 0.2% | Thermo Scientific | 85111 |
| RNA提取 | RNAqueous-Micro试剂盒 | Thermo Fisher | AM1931 |
| RNA稳定 | SEQguard Dino Preserve | Genovis | PS-SDP-024 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D球体形成与药物处理 | 细胞接种密度（HCT116 270细胞/孔，HT29 300细胞/孔）、ULA板类型（Corning 3830）、离心条件（120×g，2分钟）、球体形成时间（24小时）、药物处理时间（48小时） 阅读提示：Methods中'3D Spheroid cell painting'小节及Fig. 1图注 |
| Cell Painting染色与透明化 | 固定时间（1小时）、透化时间（1小时）、染料孵育时间（18小时，4°C）、透明化溶液组成（40%甘油/40%果糖）及透明化时间（72小时，4°C） 阅读提示：Methods中'The cell painting assay'小节及Fig. 1图注 |
| 3D成像 | 显微镜型号（Nikon ECLIPSE Ti2-E）、物镜（20×加1.5×变焦，总30×）、光学层数（12层）、层间距（5 µm）、球体检测算法参数 阅读提示：Methods中'3D Image acquisition'和'Spheroid detection method'小节 |
| 图像分割与特征提取 | Cellpose版本（v2.0）、按细胞系重新训练模型、CellProfiler特征提取参数、Pycytominer标准化流程（per-plate和per-section标准化、clipping ±40） 阅读提示：Methods中'Feature extraction and preprocessing'小节及Supplementary Table 3 |
| EdU/γH2AX验证实验 | 药物浓度（5-FU 10 µM，奥拉帕利3 µM，依托泊苷2.5 µM）、处理时间（48小时）、EdU脉冲浓度和时间（5 µM，2小时）、每条件球体数（n=13，依托泊苷n=8）、统计方法（Kruskal-Wallis和Mann-Whitney U） 阅读提示：Methods中'EdU and γH2AX assay'小节及Fig. 6图注 |
| bulk RNA-seq | HCT116细胞代次（p+9）、每条件孔数（128孔/板）、3′端计数测序平台（Illumina NovaSeq X Plus）、差异表达分析工具（edgePython v0.2.5）和GSEA工具（GSEApy v0.12） 阅读提示：Methods中'Bulk RNA-seq'小节及Supplementary Fig. 6a |