RNA测序发现他汀为上游调节因子
探究SHP-1抑制后巨噬细胞的基因表达变化，以发现潜在通路。
骨髓来源巨噬细胞分别用SWNT或SHP1i处理24小时，流式分选Cy5.5阳性细胞后进行RNA测序，并分析差异表达基因及上游调节因子。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
他汀类药物的多效性益处包括降低CD47并增强促胞葬疗法在动脉粥样硬化中的效果
The pleiotropic benefits of statins include the ability to reduce CD47 and amplify the effect of pro-efferocytic therapies in atherosclerosis
实验完整度
高包含RNA测序、体外吞噬实验、体内小鼠模型及人类样本分析等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
Apoe−/−小鼠动脉粥样硬化模型 骨髓来源巨噬细胞 小鼠主动脉血管平滑肌细胞 RAW 264.7巨噬细胞
重点核对
他汀类药物剂量：10 mg/kg/天（小鼠灌胃） CD47-SIRPα阻断方式：anti-CD47抗体（200 μg IP隔天）或SHP1i（200 μl 400 nM IV每周） 高脂饮食：21%无水乳脂、19%酪蛋白、0.15%胆固醇，持续2周后给药9周 体外处理浓度：10 μM阿托伐他汀、4 nM SHP1i、1 μM星形孢菌素（4小时） 人类样本：7例他汀治疗与7例匹配未治疗患者的颈动脉内膜剥脱标本
摘要
他汀类药物的多效性益处可能源于其对血管炎症的影响。这一现象背后的分子过程尚未完全阐明。在此，为研究CD47-SIRPα抑制后的基因表达模式而设计的RNA测序，揭示了他汀类药物、胞葬作用与血管炎症之间的联系。体内和体外研究提供的证据表明，他汀类药物通过抑制NFκB1 p50的核转位并抑制关键“不要吃我”分子CD47的表达来增强程序性细胞清除。他汀类药物以加性方式增强巨噬细胞的吞噬能力，从而增强CD47-SIRPα阻断的抗动脉粥样硬化效果。临床生物样本库标本的分析提示，他汀类药物与人类CD47表达之间存在类似联系，突出了潜在的转化意义。综上所述，我们的研究确定胞葬作用和CD47是他汀类药物多效性的关键介导因素。反过来，他汀类药物独立于任何降脂效应，增强促吞噬疗法的抗动脉粥样硬化效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 他汀类药物的多效性益处是否通过影响胞葬作用及其关键分子CD47来实现？
- 核心机制
- 阿托伐他汀通过抑制NFκB1 p50的核转位，抑制CD47的转录表达，从而增强巨噬细胞的胞葬作用，这独立于降脂效应。
- 主要证据
- RNA测序发现他汀类药物是SHP-1抑制的上游调节因子；体内外实验显示他汀与CD47-SIRPα阻断联合加性增强胞葬率并减小斑块和坏死核心；人类颈动脉样本显示他汀治疗者CD47表达较低。
- 研究意义
- 研究揭示了他汀多效性的一种机制基础，并提示促胞葬疗法与他汀联合可能作为新的治疗策略，以进一步降低动脉粥样硬化事件风险。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内动脉粥样硬化模型验证联合治疗效应
验证CD47-SIRPα阻断与他汀联合是否对动脉粥样硬化斑块有加性效果。
高脂饮食喂养的Apoe−/−小鼠接受单药或联合治疗（他汀、抗CD47抗体或SHP1i），分析主动脉根部斑块面积和坏死核心面积，并应用Bliss独立模型判断加性或协同。
体外吞噬实验和体内凋亡小体检测
检测联合治疗对胞葬率的影响及其对凋亡的影响。
用RAW 264.7巨噬细胞作为吞噬细胞，进行体外吞噬实验；体内用cleaved caspase-3免疫荧光检测凋亡小体数量。
分子机制：CD47表达和NFκB1 p50核转位
阐明他汀调节CD47表达的分子机制。
在平滑肌细胞中检测阿托伐他汀对TNF-α诱导的Cd47 mRNA和蛋白表达的影响，并通过荧光素酶报告基因检测启动子活性，以及通过免疫荧光和Western blot检测NFκB1 p50核转位，并用甲羟戊酸拮抗验证特异性。
人类样本验证
评估他汀治疗是否与人类动脉粥样硬化组织中CD47表达降低相关。
从慕尼黑血管生物库获取颈动脉内膜剥脱标本，使用RT-qPCR比较他汀治疗与未治疗组CD47 mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 纳米颗粒制备 | Cy5.5单 NHS酯 | GE Healthcare | GEPA15601 |
| NSC-87877 | Sigma-Aldrich | NSC-87877 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Scientific | 11995-065 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | SH3007103HI | |
| 青霉素/链霉素 | HyClone GE HealthCare | SV30010 | |
| 小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-02 | |
| 药物处理 | 阿托伐他汀 | Sigma-Aldrich | PZ001 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 重组小鼠肿瘤坏死因子-α | R&D systems | 410-MT | |
| DL-甲羟戊酸-5-磷酸 | Sigma-Aldrich | 79849 | |
| 凋亡诱导 | 星形孢菌素 | Sigma-Aldrich | S4400 |
| 动物实验 | 抗CD47抗体（MIAP410） | BioXCell | BE0283 |
| IgG1同型对照（MOPC-21） | BioXCell | BE0083 | |
| 高脂饮食 | 高脂饮食 | Dyets Inc. | 101511 |
| 组织学染色 | 油红O | Sigma-Aldrich | O1516 |
| Masson三色染色 | Richard-Allen Scientific | 22-110-648 | |
| 免疫荧光 | 抗Mac3抗体 | BD Life Sciences | 550292 |
| 抗裂解caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗大鼠 | Thermo Scientific | A-21247 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔 | Thermo Scientific | A11034 | |
| DAPI | -- | -- | |
| RNA提取 | miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| RT-qPCR | High-Capacity RNA-to-cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems | 4387406 |
| TaqMan通用预混液II | Applied Biosystems | 4440047 | |
| 流式细胞术 | 抗CD47抗体（FITC） | BD Life Sciences | 561890 |
| 同型对照抗体（FITC） | BD Life Sciences | 553929 | |
| Fc受体封闭抗体 | BD Biosciences | 553142 | |
| 细胞培养 | 小鼠主动脉血管平滑肌细胞 | Cell Biologics | C57-6080 |
| RAW 264.7巨噬细胞 | -- | -- | |
| 吞噬实验 | CellTracker Orange CMRA染料 | Thermo Scientific | C34551 |
| CellTracker Green CMFDA染料 | Thermo Scientific | C2925 | |
| CellTracker Deep Red染料 | Thermo Scientific | C34565 | |
| 凋亡检测 | Caspase-Glo 3/7检测系统 | Promega | G8091 |
| 免疫荧光 | 抗NFκB1 p105/p50抗体 | Cell Signaling Technology | 13586S |
| Western blot | 抗HDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 5356S |
| 蛋白提取 | 亚细胞蛋白分级提取试剂盒 | Thermo Scientific | 78840 |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78442 | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| 预制胶 | Bio-Rad | 456-1084 | |
| PVDF膜 | Life Technologies | LC2002 | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠 | Invitrogen | 32728 | |
| iBright 1500成像系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | CD47 LightSwitch启动子报告GoClones（RenSP） | SwitchGear Genomics | S710450 |
| Cypridina TK对照构建体（pTK-Cluc） | SwitchGear Genomics | SN0322S | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | L3000-008 |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Thermo Scientific | 31985062 | |
| 荧光素酶报告基因 | LightSwitch荧光素酶检测试剂盒 | Active Motif | 32031 |
| Pierce Cypridina荧光素酶发光检测试剂盒 | Thermo Scientific | PI16170 | |
| RNA测序 | Illumina Novaseq 6000 | Illumina | -- |
| UltraComp eBeads | Thermo Scientific | 01-2222-41 | |
| 流式细胞术分选 | SYTOX Blue | Invitrogen | S34837 |
| FACSAria细胞分选仪 | BD Life Sciences | -- | |
| 流式细胞术分析 | LSRII | BD Life Sciences | -- |
| 组织学 | OCT包埋剂 | VWR | 25608-930 |
| 冷冻切片机（Leica CM 1950） | Leica | -- | |
| 成像 | Zeiss Axioplan显微镜 | Zeiss | -- |
| Leica DMi8显微镜 | Leica | -- | |
| RT-qPCR | ViiA7实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 3 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA质量检测 | RNA Screen Tape | Agilent | -- |
| TapeStation 4200 | Agilent | -- | |
| 光谱测量 | NanoDrop One | Thermo Scientific | -- |
| 发光检测 | iD3发光检测仪 | Molecular Devices | -- |
| 数据分析 | Ingenuity通路分析 | Qiagen | -- |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA测序 | 骨髓来源巨噬细胞的处理浓度和时间（100 pM SWNT或SHP1i，24小时）；每组生物学重复数（3）；测序平台和读长（Illumina Novaseq 6000，PE150） 阅读提示：Methods 'Bone marrow-derived macrophages and RNA sequencing' |
| 动物实验 | 小鼠品系和遗传背景（Apoe−/−，C57BL/6J背景）；年龄（8周）；性别（雄性）；高脂饲料成分和喂食时长（21%无水乳脂、19%酪蛋白、0.15%胆固醇；先喂2周再给药9周）；给药方式、剂量和频率（他汀10 mg/kg/天灌胃；抗CD47 200 μg IP隔天；SHP1i 200 μl 400 nM IV每周）；样本量（每组9-15只） 阅读提示：Methods 'Animals and diet' |
| 体外吞噬实验 | 吞噬细胞类型（RAW 264.7）；处理浓度（10 μM阿托伐他汀，4 nM SHP1i）和时间（24小时）；靶细胞凋亡诱导剂及浓度（1 μM STS，4小时）；共培养时间（2小时）；流式检测标记物 阅读提示：Methods 'In vitro phagocytosis assay' |
| 分子机制实验 | 细胞类型（小鼠主动脉平滑肌细胞）；TNF-α浓度（50 ng/ml）；阿托伐他汀浓度（10 μM）；处理时间（CD47表达检测48小时，NFκB1 p50核转位检测TNF-α刺激45分钟）；甲羟戊酸浓度（100 μM） 阅读提示：Methods 'Cell culture', 'RNA isolation and quantitative polymerase chain reaction', 'Flow cytometry', 'In vitro immunofluorescence', 'Luciferase reporter assay', 'Protein extraction and western blotting' |
| 人类样本验证 | 样本来源（慕尼黑血管生物库）；匹配标准（年龄、性别、用药、症状、身体状况）；样本量（各7例）；RNA提取和qPCR方法 阅读提示：Methods 'Human carotid artery tissue' |