无偏蛋白质组学筛选VAV1降解剂
从苯基戊二酰亚胺化合物库中鉴定能诱导VAV1降解的CRBN分子胶
用候选化合物处理Jurkat细胞，进行SP3-based高吞吐全局蛋白质组学（DIA采集），鉴定VAV1蛋白水平显著下降的化合物。
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利用高通量蛋白质组学和基于AI的蛋白质折叠加速VAV1分子胶发现
Leveraging high-throughput proteomics and AI-based protein folding to accelerate VAV1 molecular glue discovery.
实验完整度
高包含无偏蛋白质组学筛选、细胞模型降解验证、定点突变功能验证、三元复合物建模、原代人T细胞功能实验及选择性评估
主要模型
Jurkat细胞 HEK293T/17细胞 HeLa细胞 原代人T细胞
重点核对
NGT-201-12处理Jurkat细胞24小时，10 μM，全局蛋白质组学检测VAV1降解 nLuc-VAV1截短体（ΔSH3-2等）在HeLa细胞中转染，NGT-201-12剂量反应（24小时） VAV1 SH3-2结构域RT-loop关键残基（R796A、D797A、R798A/M、S799A/R等）定点突变，nLuc降解报告基因检测 NGT-201-18处理原代人T细胞，起始浓度1000 nM，5倍系列稀释，24小时，抗CD3/CD28刺激12小时后检测CD69 NGT-201-18剂量反应全局蛋白质组学（Jurkat细胞）鉴定VAV1和LIMD1降解
摘要
本研究报道了一系列选择性诱导VAV1蛋白酶体降解的CRBN分子胶，VAV1是一种造血特异性信号蛋白，也是血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的关键靶点。利用无偏全局蛋白质组学，我们鉴定出苯基戊二酰亚胺衍生物（例如NGT-201-12）为有效的VAV1降解剂，其结合VAV1的C端SH3结构域（SH3-2）。我们阐明了SH3-2中一个非经典的RT-loop降解子（RDxS基序，残基796–799），其不同于先前表征的G-loop降解子，并得到物理学和AI驱动的GluePlex工作流程以及定点突变的支持。将自由能扰动（FEP）应用于预测的三元结构，产生的协同性指标与降解效力相关，克服了标准对接的局限性，并能够对类似物进行前瞻性排序——即使从弱初始结合物开始。我们进一步表明，通过卤素取代（例如NGT-201-18）进行构象限制可增强降解，这一原理通过DFT计算得以合理化，而全面的SAR研究为下一代降解剂绘制了路线图。剂量反应蛋白质组学确认VAV1为主要靶点，并揭示具有经典G-loop的LIMD1为脱靶，表明一种分子胶可以 engaging 不同的降解子。这些发现扩展了CRBN新底物识别的图景，并提供了一种靶向VAV1的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否发现选择性诱导VAV1蛋白酶体降解的CRBN分子胶，并阐明其降解子识别机制及优化策略？
- 核心机制
- 苯基戊二酰亚胺衍生物作为分子胶，诱导CRBN与VAV1 SH3-2结构域结合，通过非经典RT-loop降解子（RDxS基序，残基796–799）介导VAV1泛素化降解；卤素取代限制构象可增强降解效力。
- 主要证据
- 无偏全局蛋白质组学鉴定VAV1为降解新底物；nLuc-VAV1截短体和定点突变证实SH3-2的RT-loop RDxS基序必需；GluePlex建模预测三元界面并经突变验证；NanoBRET三元复合物实验和DFT计算支持构象限制增强降解；原代人T细胞中NGT-201-18降解VAV1并抑制CD69表达。
- 研究意义
- 扩展了CRBN新底物识别的降解子图景，为非经典降解子靶向的分子胶设计提供了策略，并提出了靶向VAV1治疗血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
VAV1降解的结构域定位
确定VAV1中介导CRBN:NGT-201-12复合物识别的关键结构域
构建N端nLuc标记的VAV1全长及截短体（ΔSH2、ΔSH3-1、ΔSH3-2、ΔSH2_SH3-2、ΔSH3-1_SH2_SH3-2），转染HeLa细胞，用NGT-201-12剂量反应检测荧光素酶信号。
三元复合物计算建模与界面预测
预测CRBN:NGT-201-12:VAV1 SH3-2三元复合物结构，提出关键相互作用假设
使用GluePlex流程：PeSTo预测PPI热点，HADDOCK对接生成二元模板，Boltz-2模板共折叠生成120个三元模型，UMAP分析选择高置信结构。
界面关键残基的定点突变功能验证
验证计算预测的VAV1 SH3-2界面残基（尤其是RT-loop RDxS基序）对NGT-201-12诱导降解的必要性
将预测界面残基突变为丙氨酸（或模拟VAV2/3的突变），转染HEK293T或HeLa细胞，用nLuc-VAV1报告系统检测NGT-201-12剂量反应降解。
构象限制类似物的降解效力评估与机制解析
测试卤素取代限制构象是否增强VAV1降解效力，并用DFT计算和MD模拟解释机制
合成甲基、氟、氯取代的苯基戊二酰亚胺类似物，在Jurkat VAV1-HiBiT-RR敲入细胞中检测剂量反应降解；用DFT计算二面角旋转能垒；MD模拟分析构象动态；NanoBRET检测CRBN结合和三元复合物形成。
原代人T细胞中的功能验证
验证优化降解剂NGT-201-18在原代人T细胞中降解VAV1并抑制T细胞活化的能力
从PBMC中分离CD3+ T细胞，用NGT-201-18处理24小时，抗CD3/CD28刺激12小时，Western blot检测VAV1，流式检测CD69。
剂量反应蛋白质组学评估选择性
全面评估优化降解剂的靶点降解谱和脱靶情况
对DC50<100 nM的VAV1降解剂在Jurkat细胞中进行剂量反应全局蛋白质组学，鉴定VAV1和LIMD1的剂量依赖性降解；用HiBiT-LIMD1报告基因和NanoBRET三元复合物实验验证LIMD1为脱靶。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040-CV |
| 胎牛血清 | Corning | 35-011-CV | |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| 转染 | Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 11058021 |
| Lipomaster 3000转染试剂 | Vazyme | TL301-01 | |
| CRISPR敲入 | Cas9蛋白 | Integrated DNA Technologies Inc | 1081058 |
| Neon转染试剂盒 | Invitrogen | MPK10025 | |
| Alt-R HDR增强剂V2 | Integrated DNA Technologies Inc | 10007910 | |
| 蛋白质组学样品制备 | Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78440 |
| 苯甲酸酶 | Sigma | E1014 | |
| 胰蛋白酶/LysC | Promega | V5073 | |
| StageTip | CDS Analytical | 6091 | |
| 荧光定量肽测定 | Pierce | 23290 | |
| LC-MS/MS | Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish Neo液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | J62524.AE |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | PI78440 | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| VAV1抗体（克隆D5G6） | Cell Signaling Technology | 4657 | |
| β-肌动蛋白抗体（克隆13ES） | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| HRP标记二抗 | Kindle Biosciences | R1006 | |
| SuperFemto ECL底物 | Vazyme | E423-01 | |
| 分子克隆 | KOD One DNA聚合酶 | Sigma | KMM-101NV |
| DpnI限制酶 | New England Biolabs | R0176S | |
| FastPure凝胶回收试剂盒 | Vazyme | DC301-01 | |
| ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒V2 | Vazyme | C116-01 | |
| DH5α感受态细胞 | Thermo Scientific | EC0112 | |
| HiBiT降解实验 | NanoGlo细胞裂解缓冲液 | Promega | N1573 |
| LgBiT蛋白 | Promega | N401A | |
| NanoBRET CRBN结合实验 | CRBN NanoBRET示踪分子 | Promega | CS1810C137 |
| 胞外nLuc抑制剂 | Promega | N235A | |
| NanoBRET三元复合物实验 | HIS Lite iFluor 568 Tris NTA-Ni复合物 | AAT Bioquest | 12617 |
| RT-qPCR | RNeasy Plus迷你试剂盒 | Qiagen | 74136 |
| FlysisAmp Cells-to-CT一步法SYBR Green试剂盒 | Vazyme | CL132-01 | |
| 原代T细胞分离 | MojoSort人CD3+ T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480013 |
| 流式细胞术 | PE标记抗人CD69抗体 | BioLegend | 310906 |
| DAPI | BioLegend | 422801 | |
| CD3抗体 | BioLegend | 981012 | |
| CD19抗体 | BioLegend | 982420 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全局蛋白质组学筛选 | 细胞密度（200,000细胞/孔）、化合物浓度（10 μM）、处理时间（24小时）、溶剂对照（DMSO）、生物学重复数（至少2个）和技术重复数（2个MS技术重复） 阅读提示：Methods中High-throughput global proteomics小节及Reproducibility部分；Fig. 1C, D图注 |
| nLuc-VAV1降解实验 | 细胞系（HeLa或HEK293T）、转染质粒量（150 ng）、转染试剂（Lipomaster 3000）、化合物处理时间（24小时）、荧光素酶检测底物（NanoGlo） 阅读提示：Methods中Nano luciferase degradation assay of exogenous VAV1小节；Fig. 1E、Fig. 3E图注 |
| VAV1-HiBiT-RR敲入细胞降解实验 | 细胞密度（20,000细胞/孔）、化合物稀释方式（5倍系列稀释）、处理时间（24小时）、LgBiT浓度（200 nM）、NanoGlo底物稀释倍数（100倍） 阅读提示：Methods中HiBiT degradation assay of endogenous VAV1小节；Fig. 4A图注 |
| 定点突变功能验证 | 突变残基列表（R796A、D797A、R798A、R798M、S799A、S799R、Q818A、W820A等）、细胞系、转染方法、化合物剂量反应范围 阅读提示：Methods中Molecular cloning and mutagenesis小节及Table 1；Fig. 3E图注和Supplementary Fig. 1J, 1K |
| NanoBRET三元复合物实验 | HisCRBN/HisDDB1浓度（400 nM）、iFluor 568 NTA-Ni浓度（800 nM）、furimazine浓度（5 μM）、孵育时间（2小时）、检测板类型（384孔低体积白板） 阅读提示：Methods中NanoBRET-based ternary complex formation assay小节；Fig. 4D、Fig. 7C图注 |
| 原代人T细胞活化实验 | 细胞密度（5×10^5细胞/孔）、NGT-201-18起始浓度（1000 nM）和稀释方式（5点5倍系列稀释）、预处理时间（24小时）、抗CD3/CD28刺激时间（12小时）、CD69抗体稀释比例（1:100）、DAPI浓度（30 μM） 阅读提示：Methods中Primary human T cells activation inhibition assay小节；Supplementary Fig. 6 |
| DFT计算 | 泛函和基组（B3LYP/6-31+G(d,p)）、溶剂模型（PCM水）、色散校正（Grimme D3）、扫描步长（10°）、扫描范围（键1：360°；键2：180°） 阅读提示：Methods中Dihedral angle potential energy surface scanning小节；Fig. 4F–H图注 |
| FEP+计算 | 受体结构（NGT-201-18 GluePlex预测结构）、参考配体（NGT-201-18）、微扰轮数（3轮）、偏差节点（NGT-201-11和NGT-201-12） 阅读提示：Methods中Schrodinger Glide Docking and FEP+小节；Fig. 6A, C图注 |