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        TET2缺失引发ssDNA缺口积累并增强PARP抑制剂敏感性

        TET2 loss triggers ssDNA gap accumulation and heightened PARP inhibitor sensitivity.

        作者信息Sumedha Agashe, Nidhi Athreya, William Jacobs, Christopher T Letson, Vladislav O Sviderskiy, Celia D Rouault, Yixuan Xie, Carolina Brás-Costa, Emily Zahn, Mary Claire Kendall, Alice Meroni, Matthew Wood, Barbara Soares, Jin Shao, Maggie J Cox, Luis Francisco Zirnberger Batista, Grant A Challen, John Krais, Matthew J Walter, Stephen T Oh, Benjamin A Garcia, John Edwards, Priyanka Verma, Alessandro Vindigni
        PMID42869907
        期刊Nat Commun
        发布时间2026-09-12
        DOI10.1038/s41467-026-77587-w
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        结合多种细胞模型、动物原代细胞、CRISPR筛选、患者样本及多组学功能机制验证

        主要模型

        U2OS骨肉瘤细胞系（WT、TET2 KO等） 小鼠32D髓系祖细胞系及KSL造血干祖细胞 人胚胎干细胞（hES） MDS/CMML患者骨髓样本

        重点核对

        Olaparib等PARPi处理浓度10 µM（DNA纤维/彗星实验）及48 h（集落形成实验） DNA纤维实验至少计数150条tract，N=3生物学重复 中性彗星实验至少计数100个comet，N=3 CRISPR筛选使用20 µM Olaparib及DNA修复靶向sgRNA文库 患者样本集落形成实验使用6例MDS和4例CMML样本，技术重复2次

        摘要

        年龄相关克隆性造血和造血系统肿瘤中，从头甲基转移酶DNMT3A和胞嘧啶去甲基化酶TET2的体细胞突变常见。与DNMT3A突变不同，TET2突变增加对PARP抑制剂（PARPi）的敏感性。我们发现，TET2缺失而非DNMT3A缺失，在PARPi Olaparib处理下改变DNA复制叉进程，导致更长的DNA复制 tract 和增加的DNA断裂。这揭示了TET2缺陷细胞中异常复制叉延伸与PARPi敏感性之间的新联系。TET2缺陷细胞延长的复制叉包含PRIMPOL依赖的单链（ss）DNA缺口。该表型依赖于TET2的催化活性，并通过TET1/3耗竭而减轻。此外，TET2缺失导致胞嘧啶甲基化失衡和5hmU修饰增加。这些修饰由SMUG1处理，产生脱碱基位点，可通过改良DNA纤维方法检测。CRISPR筛选鉴定出碱基切除修复核酸酶APE1与TET2缺陷细胞中增加的PARPi敏感性相关。我们提出，被PRIMPOL重新引发跳过（skipped）的脱碱基位点导致ssDNA缺口，这些缺口被APE1转化为DNA断裂，从而增加PARPi毒性。最后，我们在髓系恶性肿瘤患者的骨髓样本中鉴定TET2突变为PARPi反应的未被认识到的预测因子。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        TET2缺失如何影响PARPi处理下的DNA复制叉动态，以及这种改变是否解释TET2突变细胞对PARPi的敏感性？
        核心机制
        TET2缺失导致胞嘧啶甲基化失衡和5hmU增加，SMUG1处理产生脱碱基位点；PARP抑制下这些位点被PRIMPOL重新引发跳过形成ssDNA缺口，APE1切割缺口转化为DNA断裂，增加PARPi毒性。
        主要证据
        U2OS、32D、KSL及hES细胞中的DNA纤维、中性彗星、γ-H2AX、PLA和集落形成实验；CRISPR筛选鉴定APE1；质谱和bACE-seq显示5hmC降低、5mC和5hmU增加；患者骨髓样本集落形成实验显示TET2突变增加Olaparib敏感性。
        研究意义
        揭示TET2活性、DNA复制叉进程与PARPi反应之间的联系，并提示TET2突变可作为PARPi反应的预测因子，为扩展PARPi在携带TET2突变的MDS、CMML和AML患者中的应用提供依据。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立TET2敲除及突变细胞模型

        构建TET2缺失或催化失活的细胞模型以研究其对PARPi反应的影响

        利用CRISPR/Cas9在U2OS细胞中敲除TET2，并构建TET2-HxD和TET2-R1261G催化失活突变体进行回补；使用siRNA或基因敲除在32D、KSL、hES细胞中缺失TET2或DNMT3A。

        2

        检测PARPi处理下的复制叉进程和DNA损伤

        验证TET2缺失是否改变PARPi处理下的复制叉延伸和DNA断裂

        采用双标记DNA纤维实验检测IdU/CldU tract长度，中性彗星实验检测DSB，γ-H2AX免疫荧光检测DNA损伤；使用Olaparib 10 µM处理1 h或24 h。

        3

        验证PRIMPOL依赖的ssDNA缺口

        确定TET2缺失导致的复制叉延伸是否由PRIMPOL重新引发产生的ssDNA缺口介导

        使用S1核酸酶改良DNA纤维实验检测ssDNA缺口；siRNA敲低PRIMPOL；PLA检测PRIMPOL与EdU在新生DNA上的邻近。

        4

        检测TET2催化活性及TET家族成员的作用

        验证TET2催化活性是否必需，以及TET1/TET3是否参与该表型

        回补WT TET2、TET2-HxD或TET2-R1261G；构建TET1、TET3单敲和TET1/TET3/TET2三敲细胞；siRNA共敲低TET1和TET3。

        5

        分析DNA修饰变化及脱碱基位点来源

        明确TET2缺失引起的5hmC、5mC、5hmU变化及SMUG1/TDG在AP位点产生中的作用

        质谱定量基因组5hmC、5mC和5hmU；bACE-seq分析5hmC区域分布；改良碱性彗星实验用hSMUG1检测5hmU；siRNA敲低SMUG1或TDG；PLA检测SMUG1与EdU。

        6

        CRISPR筛选鉴定PARPi敏感性相关因子

        寻找TET2缺失细胞中对Olaparib敏感性起关键作用的基因

        使用靶向DNA修复通路的sgRNA文库在U2OS TET2 KO细胞中进行 pooled CRISPR筛选，比较DMSO和20 µM Olaparib处理下的sgRNA丰度变化。

        7

        验证APE1在PARPi敏感性中的作用

        确认APE1切割脱碱基位点导致DNA断裂并介导TET2缺失细胞的PARPi敏感性

        siRNA敲低APE1，集落形成实验检测细胞存活，DNA纤维和中性彗星实验检测复制叉和DSB；改良APE1 DNA纤维实验检测复制中AP位点。

        8

        患者骨髓样本验证TET2突变与PARPi敏感性

        在临床相关样本中验证TET2突变是否增加PARPi敏感性

        使用冷冻保存的MDS和CMML患者骨髓单个核细胞进行集落形成实验，比较TET2突变与野生型样本对Olaparib的敏感性。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹实时定量PCR细胞周期分析增殖实验
        验证细胞功能变化
        集落形成实验DNA纤维实验DNA梳中性彗星实验
        验证分子表达变化
        质谱bACE测序免疫荧光
        验证机制链路
        邻近连接实验S1核酸酶改良DNA纤维实验APE1改良DNA纤维实验hSMUG1改良碱性彗星实验CRISPR敲除RNA干扰敲低慢病毒转导
        评估体内效果
        原代人骨髓样本集落形成实验
        数据分析与统计
        MAGeCK CRISPR筛选分析Kruskal-Wallis检验及Dunn多重比较双因素方差分析及Bonferroni检验非配对t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基SigmaD6429
        胎牛血清Millipore sigmaF0926
        青霉素-链霉素Gibco15140122
        RPMI-1640培养基----
        白介素-3----
        基质胶Thermo Fisher Scientific08-774-552
        mTeSR1培养基Stem Cell Technologies85850
        杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190136
        药物处理奥拉帕利SelleckchemS1060
        维利帕尼SelleckchemS1004
        他拉唑帕利SelleckchemS7048
        多柔比星SelleckchemS1208
        顺铂Millipore sigmaP4394-250MG
        羟基脲Millipore sigmaHU H8627-5G
        DNA纤维实验S1核酸酶Thermo Fisher Scientific18001-016
        APE1核酸酶New England BiolabsM0282S
        NEBuffer 4缓冲液New England BiolabsB7004S
        大鼠抗BrdU抗体AbcamAb6326
        小鼠抗BrdU抗体BD Biosciences347580
        抗大鼠Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21470
        抗小鼠Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA21124
        Prolong Gold抗淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930
        Western blotNuPAGE LDS上样缓冲液Thermo Fisher ScientificNP0007
        NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶Thermo Fisher ScientificNP0322BOX
        NuPAGE MES SDS电泳缓冲液Thermo Fisher ScientificNP0002
        硝酸纤维素膜GE Healthcare Life Sciences10600002
        兔抗TET2抗体Cell signaling45010
        兔抗TET1抗体Cell signaling71128
        兔抗TET3抗体Cell signaling99980
        兔单克隆抗GAPDH抗体Abcamab181602
        小鼠单克隆抗PCNA抗体Santa Cruzsc-56
        单克隆抗APE1抗体Thermo Fisher ScientificMA1-440
        兔抗Vinculin抗体AbcamAb129002
        多克隆抗SMUG1抗体Thermo Fisher ScientificTA890024
        RT-qPCRPureLink RNA迷你试剂盒ThermoFisher Scientific12183018 A
        M-MLV逆转录酶ThermoFisher Scientific28025013
        iQ SYBR Green预混液Biorad1708880
        细胞周期分析Click-iT EdU成像试剂盒InvitrogenC10337
        5-乙炔基-2′-脱氧尿苷Thermo Fisher ScientificE10187
        增殖实验CellTiter-Glo发光细胞活力检测PromegaG7570
        免疫荧光小鼠抗磷酸化组蛋白H2A.X抗体Millipore05-636
        RAD51抗体Abcamab133534
        中性彗星实验彗星实验试剂盒Trevigen--
        低熔点琼脂糖Trevigen4250-50-050-02
        彗星玻片Trevigen4250-200-03
        裂解液Trevigen4250-050-01
        SYBR Gold核酸染料Thermo Fisher ScientificS11494
        5hmU彗星实验人SMUG1酶New England BiolabsM0336S
        NEBuffer 1缓冲液New England BiolabsB7001S
        CRISPR筛选Phusion聚合酶NEBM0535L
        BsmBI限制酶NEBR0580
        LRG2.1 T慢病毒载体Addgene108098
        EFS-Cas9-P2A-Puro载体Addgene108100
        邻近连接实验Duolink原位检测红色试剂SigmaDUO92008
        Duolink原位PLA抗兔PLUS探针SigmaDUO92002
        Duolink原位PLA抗小鼠MINUS探针SigmaDUO92004
        基因组DNA提取PureLink基因组DNA迷你试剂盒Thermo Fisher ScientificK182001
        质谱超级核酸酶Sino BiologicalSSNP01
        磷酸二酯酶ISigma-AldrichP3243
        小牛肠碱性磷酸酶Sigma-Aldrich524572
        Hypercarb固相萃取96孔板Thermo Scientific60302-607
        bACE-seqZymo EZ DNA甲基化直接试剂盒ZymoD5021
        APOBEC3A酶NEBE7133AA
        患者样本集落形成实验EasySep死细胞去除（Annexin V）试剂盒Stem Cell Technologies17899
        MethoCult培养基Stem Cell TechnologiesH4434
        细胞培养IMDM培养基Thermo Fisher Scientific12440053

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        DNA纤维实验
        Olaparib处理浓度10 µM，处理时间1 h或24 h；IdU 20 µM 30 min，CldU 100 µM 30 min或1 h；至少计数150条tract；N=3生物学重复
        阅读提示：Methods-DNA fiber assay及Fig. 1、2、5、6、7图注
        中性彗星实验
        Olaparib 10 µM处理1 h；至少计数100个comet；N=3
        阅读提示：Methods-Neutral comet assay及Fig. 1、2、3、4、6、7图注
        集落形成实验
        U2OS细胞每孔150个；PARPi处理48 h；培养14–15天；结晶紫染色；双因素方差分析
        阅读提示：Methods-Colony formation assays及Fig. 5、6图注
        CRISPR筛选
        MOI 0.3–0.4；Olaparib 20 µM；约44次群体倍增；sgRNA覆盖率≥1000×；MAGeCK分析
        阅读提示：Methods-CRISPR based pooled library screening及Fig. 6A
        患者样本集落形成实验
        MDS样本6例、CMML样本4例；每条件技术重复2次；培养10–14天；Olaparib梯度浓度；Stemvision计数
        阅读提示：Methods-Colony formation assays with primary human CMML/MDS samples及Fig. 8、Supplementary Fig. 8
        质谱
        2 µg基因组DNA；三重复；消化酶及浓度；ZenoTOF 7600系统检测
        阅读提示：Methods-Mass spectrometry及Fig. 4D–F

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