Cfap100敲除小鼠多器官纤毛表型分析
验证CFAP100在体内对运动纤毛和初级纤毛组装的作用。
对Cfap100敲除小鼠的脑、气管、肾、血管内皮和视网膜进行免疫荧光、扫描电镜、透射电镜、ERG及组织学分析，检测纤毛密度、长度、超微结构和视网膜功能。
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CFAP100形成相分离凝聚体，为纤毛过渡区组装所必需
CFAP100 forms phase-separated condensates required for ciliary transition zone assembly.
实验完整度
高含Cfap100敲除小鼠多器官表型、细胞模型、超分辨成像、蛋白互作、体外相分离重建及突变体功能验证
主要模型
Cfap100敲除小鼠（脑、气管、肾、视网膜等组织） CFAP100敲除RPE1细胞 Cfap100敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） IMCD3稳定表达CFAP100-GFP与ARL13B-mCherry细胞
重点核对
Cfap100敲除小鼠多组织纤毛密度、长度及结构缺陷（脑、气管、肾、血管内皮、视网膜） CFAP100敲除RPE1细胞中纤毛发生减少及CFAP100-GFP回补 rescue CFAP100敲除细胞中过渡区NPHP模块组分（NPHP1、NPHP4、NPHP3）招募受损 CFAP100与NPHP3直接相互作用（免疫共沉淀、GST pull-down、结构域定位） CFAP100相分离及F5S突变体丧失凝聚体形成、NPHP3招募和纤毛发生回补能力
摘要
纤毛是基于微管的细胞突起，对细胞信号传导和运动至关重要。纤毛过渡区连接轴丝微管与纤毛膜，并通过调控蛋白质的选择性靶向和分选发挥门控作用。然而，其组装的分子机制仍不完全清楚。本文中，我们鉴定出纤毛和鞭毛相关蛋白100（CFAP100）在过渡区组装中的重要作用。Cfap100敲除小鼠在多个器官（包括脑、气管和肾）表现出纤毛缺陷。超分辨率成像显示，CFAP100在中心粒远端形成环状结构。分子分析表明，CFAP100促进过渡区组装，并与NPHP3相互作用，NPHP3是定位于过渡区附近的inversin隔室的一个组分。进一步研究表明，CFAP100包含一个内在无序区，并在纤毛发生过程中形成动态生物分子凝聚体，这些凝聚体足以促进过渡区组装。此外，CFAP100的相分离能力与其招募NPHP3的能力相关。总之，我们的发现揭示了CFAP100相分离促进纤毛过渡区组装的机制，为支配纤毛发生的物理化学原理提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CFAP100是否以及如何调控纤毛过渡区的组装和纤毛发生。
- 核心机制
- CFAP100通过其C端内在无序区发生液-液相分离形成动态凝聚体，招募NPHP3至中心粒/过渡区，促进NPHP模块组装和纤毛过渡区组装。
- 主要证据
- Cfap100敲除小鼠多器官纤毛缺陷；CFAP100敲除RPE1细胞纤毛发生减少且过渡区NPHP模块招募受损；CFAP100与NPHP3直接互作；体外和细胞内相分离实验；F5S突变体丧失相分离能力并无法回补NPHP3招募和纤毛发生。
- 研究意义
- 揭示CFAP100相分离促进纤毛过渡区组装的机制，为纤毛发生的物理化学原理提供见解，并提示相分离失调可能广泛参与纤毛病的发生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CFAP100在细胞中的定位及对纤毛发生的作用
确定CFAP100的亚细胞定位及其在细胞水平对纤毛发生的影响。
在RPE1、MEF、NIH3T3细胞中敲低或敲除CFAP100，检测纤毛发生和长度；用3D-SIM超分辨成像分析CFAP100与中心粒标记物的相对定位；用GFP-CFAP100回补实验验证功能。
CFAP100缺失对纤毛发生各步骤及过渡区蛋白定位的影响
确定CFAP100缺失阻断纤毛发生的具体阶段及影响的过渡区组分。
在CFAP100敲除RPE1细胞中检测中心体结构、远端附属物、亚远端附属物、IFT88、CP110-CEP97及过渡区蛋白（RPGRIP1L、MKS3、CEP290、NPHP1、NPHP4、NPHP3）的定位。
CFAP100与NPHP3相互作用及结构域定位
验证CFAP100是否与NPHP模块组分直接互作并确定互作结构域。
在RPE1细胞、肾裂解液和HEK293T细胞中进行免疫共沉淀，用截短突变体进行结构域定位，并用纯化重组蛋白进行GST pull-down。
CFAP100相分离特性的细胞内外验证
验证CFAP100是否通过液-液相分离形成动态凝聚体，并确定介导相分离的结构域。
在IMCD3稳定细胞系和HeLa细胞中观察CFAP100-GFP凝聚体动态，进行FRAP、1,6-己二醇处理和融合实验；纯化IDR-mCherry进行体外液滴形成、FRAP和融合实验；用截短突变体定位相分离结构域。
相分离能力与NPHP3招募及纤毛发生回补的关系
验证CFAP100的相分离能力是否介导NPHP3招募和纤毛发生。
构建CFAP100 6A、F2S、F3S、F5S突变体，在CFAP100敲除RPE1细胞中表达，检测凝聚体形成、NPHP3招募、NPHP3结合及纤毛发生回补；用体外重建实验检测NPHP3中段向IDR-mCherry液滴的招募。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T7451 |
| 抗γ-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| 抗γ-微管蛋白抗体 | Abcam | ab11317 | |
| 免疫荧光与免疫印迹 | 抗NPHP3抗体 | Proteintech | 22026-1-AP |
| 免疫荧光 | 抗NPHP1抗体 | Proteintech | 25971-1-AP |
| 抗RPGRIP1L抗体 | Proteintech | 29778-1-AP | |
| 抗CEP164抗体 | Proteintech | 22227-1-AP | |
| 抗centrin-1抗体 | Proteintech | 12794-1-AP | |
| 抗CP110抗体 | Proteintech | 12780-1-AP | |
| 抗MKS3抗体 | Proteintech | 13975-1-AP | |
| 抗ninein抗体 | Proteintech | 13007-1-AP | |
| 抗IFT88抗体 | Proteintech | 13967-1-AP | |
| 抗ARL13B抗体 | Proteintech | 66739-1-Ig | |
| 免疫印迹 | 抗GFP抗体 | Abways | ab290 |
| 抗β-actin抗体 | Abways | AB0033 | |
| 抗Flag抗体 | Abways | AB0008 | |
| 免疫荧光 | 抗Flag抗体 | Abio-Well | AWA06018 |
| 免疫印迹 | 抗CFAP100抗体 | OriGene Technologies | TA334871 |
| 免疫荧光 | 抗GT335抗体 | AdipoGen | AG-20B-0020-C100 |
| 抗CEP290抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390462 | |
| 抗PCM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398365 | |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 质粒构建 | KOD-Plus-Neo DNA聚合酶 | TOYOBO | KOD-401 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A-Sepharose珠 | GE Healthcare | -- |
| 免疫印迹 | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| 组织学分析 | OCT包埋剂 | Sakura Tissue-Tek | -- |
| ERG记录 | RetiMINER-C视觉电生理系统 | IRC Technologies | -- |
| 重组蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B珠 | Cytiva | -- |
| His-Pur镍-NTA树脂 | Thermo Fisher Scientific, Pierce Biotechnology | -- | |
| 透射电子显微镜 | HT-7800透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 扫描电子显微镜 | TM3030扫描电子显微镜 | Hitachi Asia Ltd. | -- |
| 共聚焦成像 | Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| Andor Dragonfly 200共聚焦显微镜 | Andor | -- | |
| 荧光立体显微镜 | Leica M205FA荧光立体显微镜 | Leica | -- |
| 相分离实验 | 聚乙二醇8000 | -- | -- |
| 1,6-己二醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Cfap100敲除小鼠表型分析 | 小鼠年龄（除特别说明外均为4月龄）、遗传背景C57BL/6J、Cfap100敲除构建方式（CRISPR/Cas9）、各组织取材与定量方法、样本量（如脑室面积n=4只小鼠，气管超微结构n=15个区域来自3只小鼠） 阅读提示：Methods中Mouse studies及Figure 1图注 |
| 细胞纤毛发生诱导与回补 | 细胞系（RPE1、MEF、NIH3T3、IMCD3、HeLa、HEK293T）、血清饥饿时间（RPE1 24 h或4 h，MEF 48 h，IMCD3 2 h）、CFAP100敲除/敲低方式、回补用慢病毒载体及启动子、 puromycin筛选 阅读提示：Methods中Cell culture, transfection, and infection及Figure 2、Figure 3图注 |
| 过渡区蛋白定位与荧光定量 | 血清饥饿4 h、荧光强度测量区域（以γ-tubulin或CEP164为中心4 μm²）、每组n=120个细胞来自3次独立实验、所用抗体货号及稀释比例 阅读提示：Methods中Immunofluorescence microscopy、Image analysis及Figure 3图注 |
| CFAP100与NPHP3互作及结构域定位 | 免疫共沉淀所用抗体用量（3 μg）、细胞裂解液配方、血清饥饿4 h、截短突变体边界（NPHP3 460–1065，CFAP100 407–611）、GST pull-down重组蛋白 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation及Figure 4图注 |
| 相分离实验 | 体外缓冲液组成（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、5% PEG-8000）、蛋白浓度（20 μM）、FRAP采集间隔（5 s或15 s）、1,6-己二醇处理浓度（2.5%）和时间（5 min）、IMCD3延时成像间隔（15 min） 阅读提示：Methods中In vitro phase separation assay、Figure 5图注及Supplementary Fig. 9 |
| CFAP100突变体功能回补 | 突变体类型（6A、F2S、F3S、F5S）、在CFAP100敲除RPE1细胞中的表达水平、血清饥饿4 h、NPHP3荧光强度定量n=50个细胞、纤毛发生百分比定量n=3次独立实验 阅读提示：Figure 6图注及Supplementary Fig. 12 |