单细胞转录组图谱揭示RMS异质性
表征RMS的细胞状态和肿瘤内异质性。
对9个PDX和4个原发患者样本进行单细胞RNA测序（10x Genomics），鉴定出增殖、缺氧、凋亡、干扰素反应、内质网应激等共有细胞状态，以及肌肉分化、间充质样和神经样等RMS特异性状态。
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单细胞分析和功能表征揭示横纹肌肉瘤的干细胞层级和发育起源
Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma
实验完整度
高包含单细胞RNA测序、LARRY谱系追踪、体外肿瘤球形成实验、体内极限稀释移植实验、成骨分化实验等多层级功能验证和机制验证。
主要模型
患者来源异种移植模型（PDX） 原始患者样本（单核RNA测序） 人类胚胎、胎儿和成人骨骼肌单细胞数据 FN-RMS细胞系（RD、381T、SMS-CTR）
重点核对
FN-RMS和FP-RMS PDX的细胞移植数量（1x10^5和1x10^4）及潜伏期 单细胞移植实验（30-60个单细胞/PDX） LARRY条形码实验中RD细胞感染MOI为0.3 FACS分选标志物（CD44/CD90、CHODL/CD90等） 极限稀释肿瘤球实验和体内移植的细胞剂量
摘要
横纹肌肉瘤是一种常见的儿童癌症，与发育中的骨骼肌具有相似的特征。然而，细胞层次结构与人类肌肉发育的保守性以及分子定义的肿瘤传播细胞的鉴定尚未见报道。利用单细胞RNA测序、DNA条形码细胞命运图谱和功能性干细胞实验，我们揭示了横纹肌肉瘤与人类肌肉发育中共有的肿瘤细胞层次结构。我们还确定了肿瘤细胞停滞的常见发育阶段。融合阴性横纹肌肉瘤类似于胚胎和胎儿发育中发现的早期肌原细胞，而融合阳性横纹肌肉瘤则表达在7-7.75周龄时从胚胎向胎儿肌肉转变的肌肉细胞中发现的非常特异的基因程序。融合阳性横纹肌肉瘤也具有神经通路富集状态，表明其对肌肉谱系层次的黏附性较弱。最后，我们在融合阴性横纹肌肉瘤中鉴定了一个分子定义的肿瘤传播亚群，该亚群与能够产生肌肉和成骨细胞的双能肌肉间充质祖细胞具有显着的相似性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RMS的细胞层次结构与人类肌肉发育的保守程度，以及分子定义的肿瘤传播细胞是否存在于融合阴性RMS中。
- 核心机制
- FN-RMS中的间充质样肿瘤传播细胞与双能骨骼肌间充质干细胞（SkM. Mesen）共享转录和功能特征，并具有向肌肉和成骨分化的潜能；而FP-RMS的基因程序与胚胎向胎儿肌肉转变的特定发育阶段相关。
- 主要证据
- 基于单细胞RNA测序、LARRY谱系追踪、FACS分选、肿瘤球形成实验、体内极限稀释移植和成骨分化实验。
- 研究意义
- 揭示了RMS与正常肌肉发育的层次结构保守性，并鉴定了一个可能驱动肿瘤复发和治疗耐药的FN-RMS肿瘤传播细胞亚群，为靶向治疗提供了潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞移植验证肿瘤再增殖能力
检验单个RMS细胞是否能重建肿瘤的全部异质性。
将单个肿瘤细胞注入NSG小鼠侧腹，观察肿瘤形成并分析细胞状态。
LARRY谱系追踪揭示细胞命运
追踪FN-RMS中不同细胞状态的分化潜能和可塑性。
用LARRY条形码标记RD细胞，在正常和高/低血清条件下培养，通过单细胞RNA测序分析子代细胞的命运。
FACS分选与肿瘤球形成实验
验证间充质样细胞亚群的肿瘤起始能力。
通过FACS分选间充质样（CD44+/CD90+）和分化肌肉细胞，进行肿瘤球形成实验。
体内极限稀释移植
在体内验证间充质样细胞的肿瘤传播频率。
将不同数量的FACS分选细胞移植到NSG小鼠，观察肿瘤形成。
成骨分化实验
验证间充质样肿瘤传播细胞是否具有双能分化能力。
将分选的间充质样、分化肌肉和负选细胞在成骨分化培养基中培养18天，用茜素红S染色检测成骨分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000092/100075, |
| NextSeq 500 v2.5高输出试剂盒 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 小鼠移植 | 基质胶 | -- | -- |
| 细胞消化 | 胰蛋白酶/EDTA | -- | -- |
| 细胞分离 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 小鼠细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| FACS | PE-CD90抗体 | BioLegend | 328109 |
| FITC-CD44抗体 | BioLegend | 338803 | |
| FITC-CHODL抗体 | abcam | ab134924 | |
| FITC-TSPAN33抗体 | Fisher Scientific | MAB8405 | |
| PE-LRRN1抗体 | Creative Biolabs | 281-6 | |
| PE-ERBB3抗体 | BioLegend | 324705 | |
| DAPI | -- | -- | |
| BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD | -- | |
| qRT-PCR | NEBNext单细胞/低输入cDNA合成与扩增模块 | New England Biolabs | E6421S |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Fisher Scientific | A25742 | |
| 肿瘤球形成 | 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 组织学 | 抗MYOD抗体 | -- | -- |
| 抗Desmin抗体 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | MX1抗体 | abcam | ab95926 |
| TNNT3抗体 | abcam | ab118886 | |
| NDRG1抗体 | CST | 9485T | |
| Ki67抗体 | CST | 9449S | |
| MF20抗体 | R&D | MAB4470 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Fisher Scientific | A11034 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Fisher Scientific | A11001 | |
| 成骨分化 | 茜素红S | -- | -- |
| 其他 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | PDX和原发样本的处理，细胞数量，测序平台，以及生物信息学参数（如聚类分辨率） 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing and Single-cell and single-nucleus RNA-seq processing |
| 体内移植实验 | 移植细胞数量（1x10^5、1x10^4、单细胞），小鼠品系（NSG），观察时间 阅读提示：Methods: Mouse xenografts and Results: Not all RMS cells can initiate tumor growth |
| LARRY谱系追踪 | MOI（0.3），培养条件（高/低血清），培养时间（2天和4天），以及条形码分析参数 阅读提示：Methods: LARRY barcoding and 10X Genomics scRNA sequencing |
| FACS分选 | 抗体组合（CD44/CD90、CD90/CHODL等），细胞来源（PDX或细胞系），分选纯度和活力 阅读提示：Methods: Fluorescence activated cell sorting (FACS) |
| 肿瘤球形成实验 | 培养时间（细胞系10天，PDX 14天），培养基成分（B27、bFGF、EGF），以及细胞接种数量 阅读提示：Methods: Tumor sphere assays |