构建五种功能缺失扰动平台
建立并验证靶向非编码基因组的五种CRISPR扰动工具。
构建慢病毒表达质粒，包括sgRNA-SpCas9 KO、sgRNA-CRISPRi、pgRNA-双SpCas9、pgRNA-Big Papi和pgRNA-双enAsCas12a；在A375细胞中靶向CUL3基因的已知调控元件，通过RT-qPCR检测基因表达变化；在A549细胞中通过PCR和PAGE检测片段删除效率。
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面向非编码基因组的高效扰动
Towards efficient perturbation for the noncoding genome.
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、个体gRNA验证、深度测序、RT-qPCR、Western blot及计算模型构建与验证等多个独立证据层级。
主要模型
A549细胞（人肺癌细胞系） K562细胞（人白血病细胞系） PC-9细胞（人肺癌细胞系） A375细胞（人黑色素瘤细胞系）
重点核对
五种扰动系统在A375细胞中靶向CUL3基因已知调控元件后的基因表达变化（RT-qPCR，n=3技术重复） 在A549和K562细胞中针对69个CRE的gRNA文库筛选（6TG处理 vs DMSO对照，测序深度>500倍覆盖） 在PC-9细胞中针对约200个lncRNA的gRNA文库筛选（细胞适应度读出，维持三周） 双切割片段编辑效率检测（PCR扩增后10% TBE-PAGE，n=3生物学重复） DeepDC模型在独立pgRNA数据集上的预测性能评估（AUC、Accuracy、Precision、Recall、F1分数，5折交叉验证）
摘要
破译非编码基因组（包括重要的顺式调控元件（CRE）和转录非编码RNA基因）的功能仍具有技术挑战性。在此，我们利用大规模并行遗传筛选，系统性地基准测试了五种代表性功能缺失扰动工具的性能，包括单导RNA（gRNA）介导的SpCas9切割或CRISPR干扰，以及配对gRNA（pgRNA）涉及的双SpCas9、Big Papi（配对SpCas9和SaCas9）或双enAsCas12a片段删除方法，在解码非编码基因组作用方面的表现。对于靶向CRE（如增强子），双SpCas9在破坏功能基因组区域方面优于其他方法，效率更高。对于扰动非编码RNA基因，除了双SpCas9外，推荐使用其他RNA靶向方法（如RNA干扰）来区分转录依赖性或非依赖性作用。我们构建了一个深度学习模型DeepDC及其相关网络服务器，以促进最佳双SpCas9 pgRNA设计，从而高效删除基因组片段。总之，我们的工作为选择合适的功能缺失工具以解决非编码基因组的功能复杂性提供了实用指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何高效选择功能缺失工具来扰动非编码基因组中的顺式调控元件和非编码RNA基因，并提高片段删除效率？
- 核心机制
- 双切割片段删除方法（尤其是双SpCas9）通过产生较大的基因组片段缺失，比单切割或CRISPRi更有效地破坏非编码元件的功能；DeepDC模型整合片段长度、GC含量、sgRNA效率、表观遗传信号和Hyena序列评分等特征预测pgRNA效率。
- 主要证据
- 在A549和K562细胞中进行的CRE筛选显示双SpCas9识别出最多的功能增强子（AUC=0.70和0.72）；在PC-9细胞中的lncRNA筛选同样显示双SpCas9性能最佳（AUC=0.73）；DeepDC模型在验证实验中高分pgRNA的编辑效率和基因抑制效果显著高于低分pgRNA。
- 研究意义
- 为选择合适的功能缺失工具以解析非编码基因组功能提供了实用指导，并提供了DeepDC网络服务器辅助设计高效的双SpCas9 pgRNA。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRE筛选基准测试
比较五种工具在靶向增强子等CRE时的性能。
设计针对69个功能CRE的gRNA文库（sgRNA文库3870个gRNA；pgRNA文库分别为双SpCas9 2480对、Papi 2200对、双enAsCas12a 747对），慢病毒转导A549和K562细胞，在DMSO或2.5 μM 6TG处理下进行细胞适应度筛选，通过高通量测序定量gRNA丰度，计算sigmoid评分，定义功能CRE，并进行ROC曲线分析。
lncRNA筛选基准测试
比较五种工具在靶向长链非编码RNA基因时的性能。
设计针对约200个lncRNA的gRNA文库（sgRNA文库4217个gRNA；pgRNA文库分别为双SpCas9 3583对、Papi 2803对、双enAsCas12a 2020对），慢病毒转导PC-9细胞，维持三周进行细胞适应度筛选，通过高通量测序定量gRNA丰度，使用MAGeCK RRA算法计算tRRA评分，定义功能lncRNA，并进行ROC曲线分析。
DeepDC模型构建与验证
开发预测双SpCas9 pgRNA片段删除效率的深度学习模型，并验证其指导pgRNA设计的能力。
整合154,457个双SpCas9 pgRNA扰动数据，提取片段长度、GC含量、sgRNA效率指数、表观遗传信号和Hyena评分等特征，使用XGBoost架构训练DeepDC模型；在K562细胞中针对HS1和HS2增强子设计高评分（>0.5）和低评分（<0.2）pgRNA，通过TBE-PAGE检测编辑效率，RT-qPCR检测β-珠蛋白基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估基因组编辑效率
功能筛选
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 |
| pLenti-Cas9-Blast | Addgene | 52962 | |
| pLentiGuide-Puro | Addgene | 52963 | |
| pX601 | Addgene | 61592 | |
| pRDA_174 | Addgene | 136476 | |
| pRDA_052 | Addgene | 136474 | |
| dCas9-KRAB-MeCP2载体 | Addgene | 110821 | |
| pLKO.1-puro | Addgene | 8453 | |
| XbaI限制酶 | Takara | 1634 | |
| BamHI限制酶 | Takara | 1605 | |
| BsmBI限制酶 | New England Biolabs | R0739L | |
| EcoRI限制酶 | Takara | 1611 | |
| Esp3I限制酶 | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | |
| BpiI限制酶 | Thermo Fisher Scientific | FD1014 | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | |
| GeneJET PCR纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0702 | |
| GeneJET凝胶提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0692 | |
| 无内毒素质粒大量提取试剂盒 | TIANGEN | 4992194 | |
| 无内毒素质粒小量提取试剂盒II | TIANGEN | DP118-02 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | VivaCell BIOSCIENCES | C3114-0500 |
| RPMI-1640培养基 | VivaCell BIOSCIENCES | C3001-0500 | |
| 胎牛血清 | ExCell | FSP500 | |
| 青霉素-链霉素 | VivaCell BIOSCIENCES | C3420-0100 | |
| 慢病毒包装 | Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 51200038 |
| NeoFect转染试剂 | -- | -- | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Solarbio | B9300 |
| 6-硫代鸟嘌呤 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | CWBIO | CW2200S | |
| FLAG抗体 | Invitrogen | MA1-91878 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| HPRT1抗体 | Proteintech | 67518-1-lg | |
| PCNA抗体 | Beyotime | AF1363 | |
| PMS2抗体 | Beyotime | AF1339 | |
| MLH1抗体 | Beyotime | AF1327 | |
| MHS2抗体 | Beyotime | AF7509 | |
| MSH6抗体 | Beyotime | AF0237 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab150116 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab150080 | |
| 化学发光底物 | Sparkjade | ED0025 | |
| 成像系统 | Tanon | 5200 | |
| 流式细胞术 | 抗FLAG抗体 | Proteintech | 80801-2-RR |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| Alexa Fluor 488标记二抗（抗FLAG） | Invitrogen | A-11008 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗（抗HA） | Invitrogen | A-11001 | |
| 流式细胞仪 | BD LSRFortessa | -- | |
| RT-qPCR | UNlQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒 | Sangon Biotech | B511321 |
| MultiScribe逆转录酶 | Thermo Fisher | 4311235 | |
| 2X UltraSYBR混合物 | Sparkjade | AH0105 | |
| QuantStudio 5实时PCR系统 | Thermo Fisher | A28319 | |
| 双切割片段编辑检测 | Ex Taq DNA聚合酶 | Takara | RR001B |
| T7EI assay | Phanta Max超保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505 |
| T7核酸内切酶I | Sangon Biotech | B610169 | |
| shRNA knockdown | T4多核苷酸激酶 | thermo | EK0032 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRE筛选 | 细胞系（A549、K562）、gRNA文库覆盖度（>500倍）、6TG浓度（2.5 μM）、筛选持续时间（三周）、测序模式（PE150） 阅读提示：Methods中“CRE or enhancer screens”小节及Figure 2 legend |
| lncRNA筛选 | 细胞系（PC-9）、gRNA文库覆盖度（>500倍）、筛选持续时间（三周）、测序模式（PE150） 阅读提示：Methods中“LncRNA screens”小节及Figure 3 legend |
| 双切割片段编辑效率检测 | 细胞系、pgRNA转导MOI（~0.3）、感染后时间（7天）、PCR扩增体系、PAGE胶浓度（10% TBE-PAGE）、生物学重复数（n=3） 阅读提示：Methods中“Dual-cut fragment editing assay”小节及Figure 1d legend |
| DeepDC模型验证 | 细胞系（K562）、高/低评分pgRNA数量（n=11和n=7）、RT-qPCR检测的基因（HBE1、HBG1/2、HBB）、技术重复数（n=3） 阅读提示：Methods中“Applying the DeepDC model for enhancer characterization”相关段落及Figure 5 legend |
| T7EI assay | sgRNA数量（n=72）、PCR扩增体系、T7 Endonuclease I用量（1 μL）、消化时间（37°C 30分钟）、凝胶浓度（8% polyacrylamide TBE gels） 阅读提示：Methods中“T7 Endonuclease I assay”小节及Supplementary Fig. 1i, j |