建立Tracking-seq2检测体系
提高对DSB依赖性编辑器（Cas9、Cas12a）的脱靶检测灵敏度
在HEK293T细胞中共转染Cas9/sgRNA与T5核酸外切酶表达质粒，并添加NHEJ抑制剂KU-60648，进行Tracking-seq检测。
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利用Tracking-seq2超灵敏分析CRISPR-Cas脱靶效应
Ultra-sensitive profiling of CRISPR-Cas off-target effects with Tracking-seq2.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、多种编辑器及多种验证方法，有功能验证和机制探索
主要模型
HEK293T细胞系 人原代T细胞 人CD34+造血干/祖细胞（HSPCs）
重点核对
细胞来源和类型（HEK293T、原代T细胞、HSPCs） 基因组编辑器类型（Cas9、Cas12a、CBE、ABE、PE等） T5核酸外切酶和KU-60648的处理条件 脱靶位点验证方法（靶向扩增子测序或杂交捕获测序） Track score > 2作为阳性位点阈值
摘要
在原代人类细胞中准确检测脱靶活性对于确保基因治疗的安全性至关重要，但现有方法往往缺乏足够的灵敏度。为解决这一局限，我们开发了Tracking-seq2，这是一种先进技术，将外源性5′→3′核酸外切酶处理和非同源末端连接（NHEJ）通路抑制剂与原始Tracking-seq相结合。Tracking-seq2在分析多种基因组编辑器的脱靶位点方面表现出增强的灵敏度，包括Cas9、Cas12a、胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和先导编辑器（PE）。关键的是，Tracking-seq2可直接应用于临床相关的原代人类细胞类型，如T细胞和CD34+造血干/祖细胞（HSPC）。此外，我们的研究结果揭示基因组变异驱动不同个体间不同的脱靶异质性，突显了在临床基因组编辑应用中进行个性化安全性评估的必要性。Tracking-seq2为原代细胞中的灵敏脱靶检测提供了稳健的平台，其灵敏度与当前最先进方法相当或更高。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高原代人类细胞中CRISPR-Cas脱靶检测的灵敏度，并评估个体间脱靶异质性？
- 核心机制
- 通过外源性5′→3′核酸外切酶处理（T5）和NHEJ抑制剂（KU-60648）增加RPA结合的ssDNA中间体积累，从而放大Tracking-seq信号。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞、原代T细胞和HSPCs中，Tracking-seq2对多种编辑器检测到更多脱靶位点，且经靶向测序验证为真实脱靶事件；个体间基因组变异导致脱靶异质性。
- 研究意义
- Tracking-seq2为原代细胞提供灵敏的脱靶检测平台，强调个性化安全性评估的必要性，有助于基因编辑疗法的安全转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选增强脱靶检测的核酸外切酶和抑制剂
确定最佳核酸外切酶和NHEJ抑制剂组合
在HEK293T细胞中筛选多种细菌/噬菌体来源的5′→3′核酸外切酶和四种NHEJ抑制剂及三种RAD51抑制剂，通过Tracking-seq检测脱靶位点数量。
验证Tracking-seq2检测到的脱靶位点
确认新检测到的脱靶位点为真实编辑事件
对Tracking-seq2独有的脱靶位点进行靶向杂交捕获测序和靶向扩增子测序（含UMI），在未处理T5或KU-60648的编辑细胞中验证编辑效率。
测试Tracking-seq2对SSB依赖性编辑器（CBE、ABE、PE）的适用性
评估T5核酸外切酶单独处理是否能增强碱基编辑器和先导编辑器的脱靶检测
在HEK293T细胞中分别进行CBE、ABE、PE3编辑，共转染T5或T7核酸外切酶质粒，进行Tracking-seq检测，并对新位点进行靶向扩增子测序验证。
在原代人类细胞中应用Tracking-seq2
评估Tracking-seq2在临床相关原代细胞中的灵敏度和适用性
使用Cas9 RNP电穿孔编辑人原代T细胞和CD34+ HSPCs，进行Tracking-seq2检测，并与GUIDE-seq-2和COSMID比较，通过靶向扩增子测序验证独特位点。
分析个体间脱靶异质性
探究不同细胞类型和个体间脱靶位点的差异及其原因
比较HEK293T、HSPCs和不同供体T细胞中相同sgRNA的脱靶位点，通过靶向扩增子测序分析未编辑细胞的基因组序列，并分析表观遗传数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | HUANKE | HK-W500 | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| HSPC培养 | 无血清扩增培养基 | STEMCELL | 09650 |
| 重组人SCF | Peprotech | 300-18 | |
| 重组人TPO | Peprotech | 300-07 | |
| 重组人Flt3-L | Peprotech | 300-19 | |
| T细胞培养 | T细胞激活剂 | Miltenyi Biotec | 130-111-160 |
| X-VIVO 15培养基 | Lonza | 04-418Q | |
| 人AB血清 | Sigma-Aldrich | H4522 | |
| CTS免疫细胞血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | A4702902 | |
| 质粒构建 | T4多核苷酸激酶 | Thermo Fisher Scientific | EK0032 |
| 细胞转染 | PEI MAX转染试剂 | PolyScience | 24765 |
| 抑制剂处理 | KU-60648 | Yeasen | 53429ES08 |
| DIDS钠盐 | MCE | HY-D0086 | |
| RI-1 | MCE | HY-15317 | |
| IBR2 | MCE | HY-103710 | |
| NU7441 | MCE | HY-11006 | |
| STL127705 | MCE | HY-122727 | |
| 奥拉帕利 | MCE | HY-10162 | |
| 电穿孔 | T5核酸外切酶 | New England Biolabs | M0663L |
| 流式细胞分选 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| Tracking-seq | 刀豆蛋白A磁珠 | Polysciences | 86057-3 |
| RPA2一抗 | Millipore | MABE285 | |
| HL-dsDNase | Novoprotein | M127-01A | |
| VAHTS ssDNA文库构建试剂盒（Illumina） | Vazyme | ND620 | |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411 | |
| GUIDE-seq-2 | Tn5转座酶 | Robust | M0221 |
| 靶向扩增子测序 | QuickExtract DNA提取液 | Lucigen | QE09050 |
| 2× Phanta Max预混液 | Vazyme | P515-03 | |
| RaPure DNA纯化试剂盒 | Magen | MD010 | |
| 靶向杂交捕获测序 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| IGT®快速文库构建试剂盒v2.0 | iGeneTech | C10022 | |
| TargetSeq One®杂交清洗试剂盒v2.0 | iGeneTech | C10331 | |
| 测序 | DNBSEQ-T7测序平台 | -- | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞转染与药物处理 | 转染试剂PEI MAX用量（12 μg/孔）、质粒比例、抑制剂浓度及添加时间（KU-60648 1.25 μM转染前添加） 阅读提示：Methods中Cell transfection and nucleofection小节 |
| 电穿孔 | 细胞数量（HSPCs 1×10^6，T细胞5×10^6）、RNP组成（Cas9蛋白和sgRNA量）、T5核酸外切酶用量（5 U）、电穿孔程序（DZ-100或EO115） 阅读提示：Methods中Cell transfection and nucleofection小节 |
| Tracking-seq2检测 | 细胞输入量（5×10^5或梯度稀释）、抗体用量（RPA2 1 μg）、HL-dsDNase处理条件、文库构建试剂盒 阅读提示：Methods中Tracking-seq and Tracking-seq2小节 |
| 靶向扩增子测序 | 基因组DNA提取方法、PCR循环数（35）、UMI长度（10 bp）、测序平台 阅读提示：Methods中Targeted amplicon sequencing小节 |
| 靶向杂交捕获测序 | 基因组DNA片段大小（150-200 bp）、文库构建试剂盒、捕获探针来源、测序平台 阅读提示：Methods中Targeted hybrid capture sequencing小节 |