患者与小鼠甲状腺组织蛋白组分析
鉴定自身免疫性甲状腺炎中的差异蛋白表达及线粒体相关改变
比较自身免疫性甲状腺炎患者与健康对照甲状腺组织，以及NOD.H-2h4小鼠高碘组与正常组的甲状腺组织蛋白组，并进行功能富集分析
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
线粒体自噬缓解自身免疫性甲状腺炎中线粒体DNA诱导的cGAS-STING激活
Mitophagy mitigates mitochondrial DNA-induced activation of cGAS-STING in autoimmune thyroiditis.
实验完整度
高含患者甲状腺组织蛋白组与免疫组化、NOD.H-2h4小鼠模型、Pink1/Park2敲除小鼠、Nthy-ori3-1细胞体外实验及机制验证
主要模型
Nthy-ori3-1甲状腺滤泡上皮细胞 NOD.H-2h4小鼠高碘诱导自身免疫性甲状腺炎模型 Pink1或Park2敲除NOD.H-2h4小鼠 人桥本甲状腺炎甲状腺组织及正常对照组织
重点核对
高碘饮水浓度0.05%碘化钠，持续8周 C-176每日腹腔注射562.5 nmol，连续2周，溶剂为DMSO NaI处理Nthy-ori3-1细胞浓度40 mM，处理24 h或72 h 人甲状腺样本：63例桥本甲状腺炎与40例正常对照 Pink1/Park2敲除小鼠回交至NOD.H-2h4背景超过10代
摘要
自身免疫性甲状腺炎源于甲状腺滤泡上皮细胞稳态破坏及微环境中免疫细胞的协同激活。然而，其发病机制尚未完全阐明。在本研究中，我们鉴定出一条线粒体(mt)DNA-cGAS-STING炎症轴，其驱动小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生。相反，由PINK1和Parkin介导的泛素依赖性线粒体自噬可保护小鼠免于发病。机制上，线粒体功能障碍升高线粒体活性氧水平，激活ATM-CHK2 DNA损伤应答通路，进而磷酸化自噬衔接蛋白TAX1BP1的Ser722位点。该修饰促进线粒体募集至自噬体，从而促进线粒体自噬。损伤ATM-CHK2-TAX1BP1线粒体自噬通路会导致mtDNA泄漏至胞质，并触发cGAS-STING依赖性炎症。值得注意的是，使用C176对STING进行药理抑制可有效减缓自身免疫性甲状腺炎的进展。综上，这些发现定义了自身免疫性甲状腺炎中mtDNA驱动的致病机制，并将STING确定为潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体功能障碍驱动的mtDNA-cGAS-STING炎症轴是否参与自身免疫性甲状腺炎发病，以及拮抗该过程的线粒体自噬上游调控机制为何。
- 核心机制
- 线粒体功能障碍升高mtROS，激活ATM-CHK2通路并磷酸化TAX1BP1 Ser722，促进其结合K63连接泛素链，增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬以清除损伤线粒体；线粒体自噬受损则导致mtDNA经BAX/BAK依赖孔道泄漏至胞质，激活cGAS-STING炎症。
- 主要证据
- 患者甲状腺组织蛋白组与免疫组化、NOD.H-2h4高碘模型及Pink1/Park2敲除小鼠、Nthy-ori3-1细胞的mt-Keima、TEM、共免疫沉淀、体外激酶实验和胞质mtDNA qPCR等结果共同支持该机制；C-176抑制STING可减轻小鼠甲状腺炎。
- 研究意义
- 研究定义自身免疫性甲状腺炎中mtDNA驱动的致病机制，并将STING确定为潜在治疗靶点，提示增强线粒体自噬可能作为干预方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
甲状腺组织线粒体损伤与自噬的超微结构评估
观察线粒体损伤及含线粒体自噬体水平
采用透射电镜观察患者与小鼠甲状腺组织，计数损伤线粒体及含自噬泡的线粒体
PINK1/Parkin线粒体自噬通路表达检测
验证自身免疫性甲状腺炎中PINK1-Parkin依赖性线粒体自噬是否被激活
Western blot检测甲状腺组织PINK1、Parkin、TOM20、TIM23、FUNDC1、NIX表达，并以过量碘处理甲状腺滤泡上皮细胞观察线粒体自噬
人甲状腺样本免疫组化与相关性分析
评估cGAS-STING与线粒体自噬标志物在临床样本中的表达及与疾病进展的关系
对STING、p-TBK1、p-IRF3、PINK1、Parkin进行免疫组化染色评分，并与临床指标行相关性分析
Pink1/Park2敲除小鼠疾病表型验证
确定PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对自身免疫性甲状腺炎的保护作用
比较WT、Pink1−/−与Park2−/− ISAT小鼠的线粒体蛋白水平、超微结构、淋巴细胞浸润及血清自身抗体
ATM-CHK2-TAX1BP1机制验证
阐明线粒体功能障碍诱导线粒体自噬的上游信号与直接底物
检测NaI及DIDS处理下ATM/CHK2磷酸化，免疫共沉淀与PLA验证CHK2-TAX1BP1互作，体外激酶实验与质谱鉴定TAX1BP1 Ser722磷酸化，并用WT、S722A、S722D进行功能回补
线粒体自噬对mtDNA泄漏及cGAS-STING的调控验证
确定线粒体自噬是否抑制mtDNA释放及下游cGAS-STING激活
PicoGreen与MitoTracker共定位、胞质mtDNA qPCR、BAX/BAK及VDAC/mPTP抑制剂处理，检测STING-TBK1-IRF3磷酸化及血清IFNβ1、IL-6
STING抑制剂C-176体内疗效评估
检验药理抑制STING能否减缓自身免疫性甲状腺炎进展
在Pink1−/−与Park2−/− ISAT小鼠中给予C-176，检测TBK1/IRF3磷酸化、血清IFNβ1与IL-6、甲状腺炎症及自身抗体
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证线粒体自噬与功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗PINK1抗体 | Cell Signaling Technology | 6946 |
| 抗Parkin抗体 | Cell Signaling Technology | 4211 | |
| 抗TOM20抗体 | Cell Signaling Technology | 42406 | |
| 抗磷酸化ATM Ser1981抗体 | Cell Signaling Technology | 13050 | |
| 抗ATM抗体 | Cell Signaling Technology | 2873 | |
| 抗磷酸化CHK2 Thr68抗体 | Cell Signaling Technology | 2661 | |
| 抗CHK2抗体 | Cell Signaling Technology | 3440 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗磷酸化TBK1 Ser172抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗磷酸化IRF3 Ser396抗体 | Cell Signaling Technology | 29047 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗NIX抗体 | Cell Signaling Technology | 12396 | |
| 抗TAX1BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 5105 | |
| 抗NDP52抗体 | Cell Signaling Technology | 60732 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 抗α-Tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| 抗OPTN抗体 | Proteintech Technology | 10837-1-AP | |
| 抗BAX抗体 | Proteintech Technology | 50599-2-lg | |
| 抗BAK抗体 | Proteintech Technology | 29552-1-AP | |
| 抗TIM23抗体 | NOVUS Biologicals | NBP2-13432 | |
| 抗FUNDC1抗体 | NOVUS Biologicals | NBP1-56430 | |
| 抗p62抗体 | Sigma | P0067 | |
| 抗Parkin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32282 | |
| 抗Flag标签抗体 | Shanghai Genomics Technology | SG4110-16 | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G琼脂糖 | Santa Cruz | -- |
| 磷酸化抗体纯化 | SulfoLink偶联树脂 | Thermo Scientific | -- |
| 药物处理 | CHK2抑制剂II | Sigma | -- |
| BAX抑制剂BAI1 | MedChemExpress | -- | |
| VDAC抑制剂VBIT-4 | MedChemExpress | -- | |
| 环孢素A | MedChemExpress | -- | |
| 4,4'-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2'-二磺酸 | MedChemExpress | -- | |
| 动物实验 | C-176 | MedChemExpress | -- |
| 胞质提取 | 洋地黄皂苷 | MedChemExpress | -- |
| mtDNA提取 | QIAQuick核苷酸去除柱 | QIAGEN | -- |
| qPCR | TB Green预混Ex Taq II | TaKaRa | RR820A |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR系统 | Roche | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光底物 | Tanon | 180-5001 | |
| MicroChemi 4.2成像系统 | DNR | -- | |
| 体外激酶实验 | His-CHK2 | Thermo Fisher Scientific | PV3367 |
| 透射电镜 | Poly/bed 812环氧树脂 | Polysciences | 02597-50 |
| JEOL JEM1210透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| 荧光显微成像 | Nikon A1RHD25倒置荧光显微镜 | Nikon | -- |
| mtDNA与线粒体染色 | MitoTracker Red | Yeasen Biotechnology | -- |
| PicoGreen | Yeasen Biotechnology | -- | |
| 邻位连接 assay | NaveniFlex Cell MR Atto647N | Navinci | -- |
| 蛋白组学 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高碘诱导自身免疫性甲状腺炎小鼠模型 | 高碘饮水浓度0.05%碘化钠、处理8周、小鼠4–5周龄、每组样本量与随机分组 阅读提示：Methods 中 Cell lines and mice 小节；Fig. 1d 与 Fig. 3 图注 |
| Pink1/Park2敲除小鼠遗传背景 | 敲除品系回交至NOD.H-2h4背景超过10代、每代PCR基因分型 阅读提示：Methods 中 Cell lines and mice 小节 |
| C-176体内给药 | 剂量562.5 nmol/日、溶剂DMSO 200 μL、连续2周、给药途径为每日注射 阅读提示：Methods 中 Cell lines and mice 小节；Fig. 6a 图注 |
| Nthy-ori3-1细胞NaI处理 | NaI浓度40 mM、处理时间24 h或72 h、培养基为RPMI-1640含10% FBS 阅读提示：Methods 中 Cell lines and mice 与 Detection of mtDNA in cytosolic extracts 小节；Fig. 4 图注 |
| 人甲状腺样本免疫组化 | 桥本甲状腺炎63例与正常对照40例、取材2019–2023年、染色评分由两名盲法评估者独立完成 阅读提示：Methods 中 Human thyroid samples 与 Immunohistochemical staining 小节 |
| mtDNA泄漏通道抑制剂实验 | BAI1 5 μM、VBIT-4 5 μM、CsA 2.5 μM的处理条件 阅读提示：Results 中 Mitophagy suppresses mtDNA release-induced cGAS-STING activation 小节及 Supplementary Fig. 9 |