患者样本采集与TTR基因分型
确认患者携带的TTR突变并获取用于纤维提取的活检组织
采集腓肠肌肌肉活检和玻璃体样本，提取外周血DNA，PCR扩增TTR四个外显子并进行Sanger测序
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遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性中活检来源的TTR纤维冷冻电镜结构
Cryo-EM structures of biopsy-derived TTR fibrils in hereditary transthyretin amyloidosis.
实验完整度
高含患者腓肠肌活检与玻璃体样本、19个冷冻电镜结构、深度学习密度分析与质谱验证
主要模型
ATTRv患者腓肠肌肌肉活检组织 ATTRv患者玻璃体样本 患者来源TTR淀粉样纤维
重点核对
10例ATTRv患者携带9种不同杂合突变，腓肠肌活检9例、玻璃体1例 冷冻电镜结构分辨率1.9–3.4 Å，共19个TTR纤维结构 CryoAtom与ModelAngelo预测突变位点氨基酸频率，≥70%阈值判定突变型或野生型优势 ATTRv-F64S玻璃体样本进行自下而上质谱，检测F64（野生型）与S64（突变型）肽段 ATTRv-V30A type I结构通过参考密度混合法进行Q-score定量
摘要
遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRv）是一种致死性常染色体显性疾病，其特征为转甲状腺素蛋白（TTR）淀粉样纤维的系统性沉积，导致进行性神经病和心肌病。已发现TTR基因中超过130种致病突变，但其在TTR纤维形成和疾病发病机制中的作用仍不清楚。本文中，我们利用冷冻电镜（cryo-EM），呈现了来自10例携带9种不同杂合突变的存活ATTRv患者的腓肠肌活检和玻璃体的19个高分辨率TTR纤维结构（1.9–3.4 Å）。基于深度学习的冷冻电镜密度分析能够对纤维内突变型或野生型的优势进行半定量评估。这些组成谱结合其结构，提示疾病发病与主要启动淀粉样形成的TTR种类（野生型或突变型）之间存在关联。这种基于活检的工作流程拓宽了淀粉样结构研究对患者组织的获取途径，使异质性遗传性淀粉样变及突变在淀粉样形成中作用的系统研究成为可能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATTRv中不同TTR基因突变如何影响TTR纤维形成、纤维组成及疾病发病，突变型与野生型TTR在淀粉样沉积中的角色是什么
- 核心机制
- 突变引起的结构改变主要局限于突变位点附近，取决于替换残基与ATTRwt折叠的相容性，多由侧链大小的空间位阻不相容驱动；纤维组成可分为突变型优势、野生型优势和混合型，疾病发病年龄与主导淀粉样成核的TTR种类相关：突变型TTR驱动的淀粉样变通常发病较早，野生型驱动的发病较晚
- 主要证据
- 来自10例ATTRv患者腓肠肌活检和玻璃体的19个冷冻电镜纤维结构、CryoAtom与ModelAngelo密度预测的突变位点组成分析、ATTRv-V30A type I参考密度Q-score定量，以及ATTRv-F64S样本质谱检测到野生型与突变型肽段且突变型峰面积较高
- 研究意义
- 基于活检的工作流程拓宽了淀粉样结构研究对患者组织的获取途径，可用于异质性遗传性淀粉样变的系统研究及精准分类，并有助于理解ATTRv发病年龄异质性的分子机制
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TTR纤维提取
从微量活检组织中获取足够TTR纤维用于冷冻电镜
简化水提取流程，跳过多次水提取步骤；肌肉组织匀浆、离心、胶原酶消化后重悬于冰水；玻璃体样本离心浓缩后重悬于冰水
冷冻电镜数据采集与螺旋重建
解析TTR纤维高分辨率结构
制备冷冻样品，采集图像，RELION-5.0进行运动校正、CTF估计、二维分类、三维自动精修、贝叶斯抛光和CTF精修，并进行三维分类分析结构异质性
原子模型构建与验证
建立并验证各纤维结构的原子模型
以PDB 8ADE为初始模型在Coot中手动建模，PHENIX实空间精修与Coot手动调整迭代，MolProbity验证，并用第二半图确认无过拟合
基于密度的突变位点氨基酸预测与纤维组成分类
半定量评估纤维中野生型与突变型TTR的优势
用CryoAtom和ModelAngelo在不输入序列信息的情况下预测突变位点氨基酸，统计中央30个rung中最可能氨基酸频率，并据此分类为野生型优势、突变型优势或混合型
参考密度定量验证纤维组成
验证ATTRv-V30A type I中突变型与野生型TTR的比例
将同一图谱中V32和A97分离对齐并按不同比例混合生成参考标准，计算缬氨酸γ-碳原子平均Q-score进行定量
质谱验证纤维组成
验证ATTRv-F64S玻璃体纤维中野生型与突变型TTR的存在及相对比例
对ATTRv-F64S纤维样本进行自下而上质谱，检测含F64或S64的肽段并比较峰面积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TTR基因分型 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| ABI 3730XL DNA分析仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TTR纤维提取 | 胶原酶 | Sigma | 9001-12-1 |
| 质谱 | 二硫苏糖醇 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| C18柱 | Sigma | -- | |
| Acclaim PepMap100捕集柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy分析柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 冷冻电镜 | Nanodim金载网R1.2/1.3，300目 | Nanodim | -- |
| Coolglow辉光放电系统 | -- | -- | |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Titan Krios显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| Falcon 4i探测器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本与突变谱 | 10例患者中腓肠肌9例（V30M、V30A、F33V、K35N、T59K、E61K、G83R×2、A97S）与玻璃体1例（F64S）；性别分布1女9男；早发/晚发以50岁为界 阅读提示：Methods的Source of ATTRv fibrils及Supplementary Table 1 |
| TTR纤维提取 | 肌肉组织用量3–40 mg、胶原酶5 mg/mL过夜、离心条件3100 × g；玻璃体100,000 × g 60 min 阅读提示：Methods的Extraction of TTR fibrils |
| 冷冻电镜数据采集 | 载网类型、辉光放电参数、300 kV Titan Krios与Falcon 4i；详细采集参数 阅读提示：Methods的Cryo-EM及Supplementary Data 1 |
| 突变位点组成预测与分类 | CryoAtom与ModelAngelo版本、中央30 rung统计、≥70%阈值、对照图谱选择标准与排除标准 阅读提示：Methods的Cryo-EM density-based prediction of protein variants及Supplementary Data 3 |
| 质谱验证 | 样本量5 μL（n=1）、胰蛋白酶消化、Q Exactive数据依赖top 20采集、MASCOT搜索参数与FDR 1% 阅读提示：Methods的Mass spectrometry及Supplementary Table 3 |