MAzyme及MMAzyme-S的合成与表征
构建具有多孔结构和多酶活性的铜-氨基酸纳米酶，并实现SHP1i负载和巨噬细胞膜伪装。
以甘氨酸和铜离子配位形成Gly-Cu(II)前体，在碱性条件下水解形成MAzyme，再负载SHP1i，并用RAW 264.7来源巨噬细胞膜包覆；通过TEM、HRTEM、FTIR、XPS、XRD、BET、DLS和Western blot等进行表征。
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仿生多孔金属-氨基酸纳米酶通过抗氧化和促胞葬作用实现动脉粥样硬化的多通路治疗
Bioinspired porous metal-amino acid nanozymes enable multi-pathway treatment of atherosclerosis through anti-oxidation and pro-efferocytosis.
实验完整度
高含体外细胞模型、斑块靶向成像和ApoE−/−小鼠体内疗效验证，并进行了抗氧化、促胞葬及机制验证
主要模型
RAW 264.7巨噬细胞 HUVECs 雄性ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化模型 雄性C57小鼠生物安全性评价
重点核对
MMAzyme-S在ApoE−/−小鼠中以5 mg kg−1每周静脉注射，治疗8周，每组n=10 体外抗氧化和抗炎实验使用RAW 264.7细胞，H2O2或LPS刺激，纳米酶浓度10 μg mL−1 胞葬实验使用LPS和IFN-γ诱导的促炎巨噬细胞，凋亡细胞与吞噬细胞比例4:1，共孵育2 h 斑块负荷以主动脉整体及主动脉根部ORO染色面积定量评估 SHP1磷酸化水平和Mertk表达作为胞葬相关机制验证指标
摘要
动脉粥样硬化的特征是慢性炎症、持续氧化应激、内膜脂质蓄积以及斑块内胞葬作用受损。本文中，我们开发了一种通过金属-氨基酸配位组装的铜基多孔纳米酶（MAzyme），用于负载抗吞噬性CD47-SIRPα信号通路抑制剂，并用巨噬细胞膜进行伪装。所得仿生纳米平台（MMAzyme-S）继承了多孔纳米酶的多酶活性和生物膜的炎症归巢特性。MAzyme显著的抗氧化效果可与天然超氧化物歧化酶相媲美，通过清除活性氧实现有效的炎症消退。我们的发现还表明，MMAzyme-S可阻断CD47介导的抗吞噬作用，恢复病灶巨噬细胞中受损的胞葬作用，从而促进凋亡细胞的吞噬清除。此外，通过协同抗氧化和抗炎作用，胆固醇转运通路得到增强，从而显著减少泡沫细胞形成和斑块负荷。因此，凭借同源炎症靶向和多环节干预发病机制的独特优势，MMAzyme-S降低了雄性ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化斑块负荷。本研究凸显了具有抗氧化和促胞葬联合活性的仿生多孔MAzyme作为多层面干预策略对抗动脉粥样硬化的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否构建一种兼具抗氧化和促胞葬活性的仿生多孔纳米酶平台，实现对动脉粥样硬化氧化应激、炎症、胞葬缺陷和胆固醇蓄积的多环节干预。
- 核心机制
- 铜-甘氨酸配位形成的多孔MAzyme具有类SOD/CAT/GPx/POD多酶活性，可清除ROS并抑制炎症；负载SHP1i后阻断CD47-SIRPα下游SHP1磷酸化，恢复巨噬细胞胞葬作用；同时上调PPARγ-LXRα-ABCA1/ABCG1通路促进胆固醇外流，减少泡沫细胞形成。
- 主要证据
- 在RAW 264.7和HUVECs中验证抗氧化、抗炎、促胞葬和促胆固醇外流；在ApoE−/−小鼠中验证斑块靶向、斑块负荷降低、坏死核心缩小及SHP1磷酸化和胞葬相关指标变化。
- 研究意义
- 本研究提出了一种将抗氧化纳米酶与促胞葬抑制剂的递送相结合的仿生多孔纳米平台，可作为针对动脉粥样硬化发病机制的多层面干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MAzyme多酶活性及催化机制验证
验证MAzyme的类SOD、CAT、GPx和POD活性，并阐明甘氨酸配位对催化活性的贡献。
采用ESR、WST-8法、NBT法、H2O2吸收和溶氧检测、TMB显色、GPx试剂盒及DFT计算评估多酶活性和反应能垒。
体外抗氧化、抗炎及巨噬细胞极化调控验证
评估MMAzyme-S对氧化应激、炎症因子分泌、巨噬细胞迁移和M1/M2极化的影响。
在RAW 264.7细胞中经H2O2或LPS刺激后，用DCFH-DA检测ROS，CCK-8检测细胞活力，ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10，Transwell检测迁移，流式检测CD86/CD206极化。
体外促胞葬和胆固醇外流验证
验证MMAzyme-S恢复促炎巨噬细胞对凋亡细胞（包括CD47过表达凋亡细胞）的吞噬，并促进泡沫细胞胆固醇外流。
以LPS和IFN-γ诱导促炎巨噬细胞，用STS诱导凋亡细胞或TNF-α/ox-LDL诱导CD47过表达凋亡细胞，流式和CLSM检测胞葬；用ox-LDL和LPS诱导泡沫细胞，ORO染色和总胆固醇试剂盒检测胆固醇外流，Western blot检测Mertk、PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1。
体内生物安全性、斑块靶向及疗效评价
评估MMAzyme-S在ApoE−/−小鼠中的斑块靶向能力、生物相容性和抗动脉粥样硬化疗效。
以Cy5.5或ICG标记纳米酶进行离体荧光和光声成像；ApoE−/−小鼠高脂饮食后随机分组，每周静脉注射盐水、MAzyme、MAzyme-S或MMAzyme-S，8周后评估主动脉ORO染色、主动脉根部H&E、Masson、α-SMA、MMP-9、p-SHP1、Mac-3/cleaved caspase-3等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| SHP1i负载 | NSC-87877 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养与刺激 | 脂多糖 | -- | -- |
| 干扰素γ | -- | -- | |
| 肿瘤坏死因子α | -- | -- | |
| 氧化低密度脂蛋白 | -- | -- | |
| 星形孢菌素 | -- | -- | |
| 流式分析 | FITC抗小鼠CD86抗体 | BioLegend | 105005 |
| CD206-APC抗体 | BioLegend | 141707 | |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定试剂盒 | Abclonal | -- |
| Western blot | CD47兔多克隆抗体 | ABclonal | A1838 |
| CD36/SR-B3兔多克隆抗体 | ABclonal | A5792 | |
| CCR2兔多克隆抗体 | ABclonal | A2855 | |
| Na-K-ATP兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11400 | |
| MERTK兔多克隆抗体 | ABclonal | A5443 | |
| LXRα兔单克隆抗体 | ABclonal | A3974 | |
| ABCG1兔单克隆抗体 | ABclonal | A17907 | |
| PPARγ兔多克隆抗体 | Wanleibio | WL01800 | |
| 抗ABCA1抗体 | Abcam | AB307536 | |
| GAPDH兔多克隆抗体 | ABclonal | AC001 | |
| 磷酸化SHP1抗体 | Cell Signaling Technology | 8849 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG抗体 | ABclonal | AS014 | |
| 细胞荧光标记 | CellTracker红色荧光探针 | -- | -- |
| CellTracker绿色荧光探针 | -- | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA活性氧荧光探针 | -- | -- |
| SOD活性检测 | 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | -- | -- |
| GPx活性检测 | 谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 | -- | -- |
| 胆固醇检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | -- | -- |
| 光声成像 | 吲哚菁绿 | -- | -- |
| 荧光成像 | 花菁5.5 NHS酯 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MAzyme合成 | 铜醋酸盐一水合物2 g、甘氨酸1.5 g、70°C混合、乙醇25 mL、冰浴至0°C；前体140 mg、20 mL水、960 μL 1.2 M NaOH；离心条件8594×g、5 min 阅读提示：Methods - Synthesis of MAzyme and MAzyme-S |
| MMAzyme-S组装 | SHP1i（NSC-87877）浓度1 mg mL−1，与MAzyme 1 mg mL−1等体积混合，4°C过夜；巨噬细胞膜与MAzyme-S重量比5:1，超声1 min 阅读提示：Methods - Synthesis of MAzyme and MAzyme-S；Synthesis of MMAzyme-S |
| 体外抗氧化与抗炎处理 | RAW 264.7细胞密度、H2O2 400 μM或100 μM、LPS 1 μg mL−1、纳米酶10 μg mL−1、处理12 h或24 h 阅读提示：Methods - In vitro protective effect against oxidative injury；In vitro ROS scavenging ability；Anti-inflammatory effects on macrophages polarization |
| 胞葬实验 | LPS 1 μg mL−1 + IFN-γ 20 ng mL−1诱导24 h；STS 1 μM 4 h诱导凋亡；TNF-α 50 ng mL−1 + ox-LDL 50 μg mL−1 24 h诱导CD47过表达；凋亡细胞:吞噬细胞=4:1，共孵育2 h 阅读提示：Methods - Efferocytosis assay；Fig. 5 legend |
| 体内治疗实验 | 6周龄雄性ApoE−/−小鼠高脂饮食5周，随机分四组每组n=10，静脉注射5 mg kg−1每周一次共8周，另设4周停药观察 阅读提示：Methods - In vivo therapeutic efficacy；Experimental animals；Fig. 6e legend |
| 斑块靶向与光声成像 | Cy5.5或ICG标记纳米酶，光声波长800 nm、频率40 MHz、2D增益24 dB、PA增益35 dB；每组n=3 mice 阅读提示：Results - In vivo biocompatibility and plaque-targeting capability of MMAzyme-S；Fig. 6 legend；Methods - In vivo therapeutic efficacy |