建立基因敲除细胞系
研究特定翻译因子在米托核糖体翻译中的功能
利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建mtRF1L、mtRF1、mtRRF、ICT1、mtRF-R、HEMK1等基因敲除的HeLa细胞，mtRF1敲除的C2C12细胞，使用已有mtIF3敲除HEK293细胞和mtRES1敲除HAP1细胞。
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线粒体翻译终止、回收、重新起始及对框内和框外情境的救援
Mitochondrial translation termination, recycling, reinitiation, and rescue for in-frame and out-of-frame contexts.
实验完整度
高体外细胞模型（多种KO细胞系）结合Ribo-Seq/Disome-Seq、Western blot、mito-FUNCAT、结构建模及功能验证
主要模型
HeLa细胞（野生型及mtRF1L、mtRF1、mtRRF、ICT1、mtRF-R、HEMK1等基因敲除） HEK293细胞（mtIF3敲除及野生型） HAP1细胞（mtRES1敲除及野生型） C2C12小鼠细胞（mtRF1敲除及野生型）
重点核对
细胞模型与基因型：HeLa、HEK293、HAP1、C2C12及相应基因敲除细胞系（包括mtRF1L、mtRF1、mtRRF、mtIF3、ICT1、mtRF-R、mtRES1、HEMK1 KO） MitoIP-Thor-Ribo-Seq和MitoIP-Thor-Disome-Seq的测序平台、读长模式及A位点偏移估计 on-gel mito-FUNCAT处理条件：50 µM HPG、100 µg/ml anisomycin处理3小时 Western blot所用抗体及稀释比例（如anti-mtRF1 1:200或1:1000等） CRISPR-Cas9敲除的sgRNA序列及敲除验证方法（Sanger测序和Western blot）
摘要
由于线粒体在进化过程中与细菌祖先分化，线粒体蛋白质合成系统包含具有独特特征的mRNA和翻译因子。然而，翻译终止、回收和质量控制背后的分子机制仍不清楚。在此，我们通过高分辨率线粒体Ribo-Seq和Disome-Seq揭示：释放因子对不同类型终止密码子的特异性；mtRF1在脊椎动物中的作用，这些脊椎动物的主要翻译子（translon）中不含非经典终止密码子；内部翻译子的回收偶联翻译；以及线粒体核糖体在延伸早期阶段的救援。mtRF1L识别所有终止密码子，而mtRF1仅识别AGA/AGG非经典终止密码子。此外，mtRF1终止以AGA/AGG结尾的框外翻译子的翻译。我们还发现，mtRRF和mtIF3是终止密码子处线粒体核糖体回收以及内部翻译子翻译重新起始所必需的。停滞在起始密码子和/或延伸早期阶段的线粒体核糖体是救援因子ICT1、mtRF-R和mtRES1的主要底物。此外，HEMK1介导的释放因子甲基化增强了终止密码子上的终止反应。我们的结果提供了与蛋白质合成完成相关的线粒体核糖体动力学的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体翻译终止、核糖体回收、重新起始以及停滞核糖体救援的分子机制是什么？
- 核心机制
- mtRF1L识别所有终止密码子（包括经典和非经典），mtRF1特异性识别AGA/AGG非经典终止密码子并终止框外翻译子；mtRRF和mtIF3介导终止后39S与28S解离及内部翻译子的重新起始；ICT1、mtRF-R和mtRES1救援停滞在起始密码子和早期延伸阶段的线粒体核糖体；HEMK1介导的GGQ甲基化增强终止反应。
- 主要证据
- 在多种基因敲除细胞系中通过MitoIP-Thor-Ribo-Seq和MitoIP-Thor-Disome-Seq检测线粒体核糖体占据和碰撞，结合on-gel mito-FUNCAT、Western blot及结构建模验证。
- 研究意义
- 提供了与蛋白质合成完成相关的线粒体核糖体动力学见解，有助于理解线粒体翻译终止、回收、重新起始和救援过程。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MitoIP-Thor-Ribo-Seq和Disome-Seq检测核糖体占据和碰撞
在全转录组水平分析线粒体核糖体在不同终止密码子处的停顿、碰撞及3'UTR/poly(A)尾部累积
裂解细胞、免疫沉淀纯化线粒体、RNase消化、蔗糖垫超速离心、凝胶筛选17-50 nt（单核糖体）和50-80 nt（双核糖体）足迹，建库测序。
on-gel mito-FUNCAT检测线粒体翻译活性
验证基因敲除对全局线粒体翻译及特定蛋白合成的影响
细胞在无甲硫氨酸培养基中加50 µM HPG和100 µg/ml anisomycin处理3小时，裂解后用Click-it反应标记新生肽，SDS-PAGE分离，Odyssey CLx检测荧光信号。
Western blot检测蛋白水平
验证敲除效率及线粒体编码蛋白的稳态水平
使用特异性抗体检测mtRF1L、mtRF1、mtRRF、MT-CO1、MT-CO2、MT-ATP8、MT-ATP6、MT-CYB、MT-ND4L、MT-ND4等蛋白。
结构建模分析mtRF1L与AGA/AGG密码子的相互作用
从结构角度解释mtRF1L识别非经典终止密码子的可能性
基于已报道的mtRF1L与UAA密码子复合物冷冻电镜结构（PDB ID: 7NQH），用Coot手动替换密码子为AGA/AGG并拟合邻近残基，进行局部正则化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证细胞功能变化
结构建模
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 支原体PCR检测试剂盒 | iNtRON Biotechnology | -- |
| 基因敲除 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| pL-CRISPR.EFS.GFP质粒 | Addgene | 57818 | |
| pL-CRISPR.EFS.tRFP质粒 | Addgene | 57819 | |
| MitoIP-Thor-Ribo-Seq和Disome-Seq | 人线粒体分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 小鼠组织线粒体分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒（人/小鼠/大鼠） | Illumina | -- | |
| 人Ribo-Seq核糖体RNA去除试剂盒 | siTOOLs Biotech | -- | |
| 小鼠/大鼠Ribo-Seq核糖体RNA去除试剂盒 | siTOOLs Biotech | -- | |
| T7-Scribe标准RNA体外转录试剂盒 | CELLSCRIPT | -- | |
| on-gel mito-FUNCAT | L-高炔丙基甘氨酸 | Jena Bioscience | -- |
| 茴香霉素 | Alomone Labs | -- | |
| IRdye800CW叠氮化物 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Click-it细胞反应缓冲液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Odyssey CLx成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| GelCode Blue Safe蛋白染色液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | MBL | M177-3 |
| 抗TOMM20抗体 | CST | 42406 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | CST | 2144 | |
| 抗mtRF1L抗体 | Proteintech | 16694-1-AP | |
| 抗mtRF1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-97988 | |
| 抗mtRF1抗体 | Atlas Antibodies | HPA043316 | |
| 抗mtRRF抗体 | Proteintech | 12357-2-AP | |
| 抗MT-CO1抗体 | Abcam | ab203912 | |
| 抗MT-CO2抗体 | Proteintech | 55070-1-AP | |
| 抗MT-ATP8抗体 | Proteintech | 26723-1-AP | |
| 抗MT-ATP6抗体 | CST | 70262 | |
| 抗MT-CYB抗体 | Proteintech | 55090-1-AP | |
| 抗MT-ND4L抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-68242 | |
| 抗MT-ND4抗体 | Merck Millipore | MABS1994 | |
| 抗MRPS22/mS22抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-52249 | |
| 抗MRPL45/ml45抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-54784 | |
| 抗ICT1抗体 | Proteintech | 10403-1-AP | |
| 抗mtRF-R抗体 | Proteintech | 24646-1-AP | |
| 抗mtRES1抗体 | Abcam | ab151066 | |
| IRDye800CW标记抗兔IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye800CW标记抗鼠IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | |
| 细胞活力检测 | RealTime-Glo MT细胞活力检测试剂 | Promega | -- |
| GloMax Navigator发光检测系统 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MitoIP-Thor-Ribo-Seq和MitoIP-Thor-Disome-Seq | 细胞系来源及基因型（HeLa、HEK293、HAP1、C2C12及相应基因敲除细胞系）；线粒体分离试剂盒品牌（Miltenyi Biotec）；RNase消化条件；单核糖体和双核糖体足迹的凝胶筛选范围（17-50 nt和50-80 nt）；测序平台和读长模式（HiSeq X/NovaSeq X Plus 150 bp双端或NovaSeq 6000 100 bp单端） 阅读提示：Methods中“Lysate preparation for MitoIP-Thor-Ribo-Seq and MitoIP-Thor-Disome-Seq”和“Library preparation for MitoIP-Thor-Ribo-Seq and MitoIP-Thor-Disome-Seq”小节，以及Supplementary Data 1 |
| on-gel mito-FUNCAT | HPG浓度（50 µM）；anisomycin浓度（100 µg/ml）；处理时间（3小时）；IRdye800CW Azide浓度（50 µM）；检测仪器（Odyssey CLx）及信号标准化方法（CBB染色） 阅读提示：Methods中“On-gel mito-FUNCAT”小节 |
| Western blot | 各抗体品牌、货号及稀释比例；二抗稀释比例（1:10000）；成像系统（Odyssey CLx） 阅读提示：Methods中“Western blotting”小节 |
| 基因敲除细胞系构建 | sgRNA序列；转染试剂（Lipofectamine 3000）；分选时间（转染后48小时）；克隆方法（有限稀释法）；敲除验证方法（Sanger测序和Western blot） 阅读提示：Methods中“KO cell lines”小节 |
| 结构建模 | 起始结构PDB ID（7NQH）；建模软件（Coot）；建模策略（手动替换密码子并拟合残基） 阅读提示：Methods中“Modeling structures”小节 |