构建并验证免疫原性递增的慢病毒载体系列
建立可在原位肺癌中模拟不同强度新抗原表达的载体系统。
构建Lenti:Cre、Lenti:mCh/Cre、Lenti:mCh-SIIN/Cre三种载体，经气管内吸入起始KrasLSL-G12D/+小鼠肺部肿瘤，并在8、12、16周检测肿瘤大小与mCherry表达。
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抑癌基因型影响肺癌中免疫监视的程度与模式
Tumor suppressor genotype influences the extent and mode of immunosurveillance in lung cancer.
实验完整度
高含体外细胞系、原位小鼠肺癌模型、单基因敲除与Tuba-seq多重体内筛选，并行抗原呈递与免疫细胞功能验证
主要模型
KrasLSL-G12D/+（K）原位小鼠肺癌模型 KrasLSL-G12D/+;Rosa26LSL-Cas9::GFP 小鼠（K;Cas9） KrasLSL-G12D/+;Rag1−/−（K;Rag1−/−）小鼠 LG1233细胞系及GFP靶向sgRNA条形码基准细胞
重点核对
慢病毒滴度：Lenti:Cre、Lenti:mCh/Cre、Lenti:mCh-SIIN/Cre 各1×10^5 PFU/只；含sgRNA载体6×10^4 PFU/只；Tuba-seq K;Cas9每病毒6×10^4 PFU（共1.8×10^5 PFU），K小鼠每病毒1×10^5 PFU（共3×10^5 PFU） 时间点：初始免疫原性系列肺组织于肿瘤起始后8、12、16周取材；抑癌基因单敲除与Tuba-seq分析于12周取材 分组：非靶向sgRNA对照（TSWT）与Lkb1、Setd2、Rb1敲除；Tuba-seq含11个抑癌基因及B2M、PD-L1对照sgRNA 检测终点：H&E肿瘤面积、肿瘤负荷、mCherry IHC阳性比例、CD45/CD3/CD8/FoxP3/Ly6G/Arginase I IHC、流式H2Kb-SIINFEKL呈递及T细胞表型 统计设计：单因素ANOVA（Šidák校正）、Kruskal-Wallis、卡方/Fisher精确检验、Student t检验及bootstrap重采样（10,000次）
摘要
癌症驱动突变如何影响贯穿肿瘤发展过程的免疫监视仍知之甚少。为更好地理解肿瘤基因型对免疫监视的贡献，我们构建并验证了可产生免疫原性递增的新抗原的慢病毒载体。该载体系统适用于由Cre调控的原位癌症模型、CRISPR/Cas9介导的体细胞基因组编辑以及肿瘤条形码标记。在此我们显示，在致癌KRAS驱动的肺癌和强新抗原表达背景下，抑癌基因型决定免疫细胞募集程度、对新抗原沉默肿瘤的阳性选择以及肿瘤向外生长。通过定量11个常见失活抑癌基因在不同新抗原背景下对肿瘤生长的影响，我们显示抑癌基因失活的促生长效应与对免疫监视敏感性增加相关。重要的是，某些基因型还独立于其促生长效应而显著改变对免疫监视的敏感性。我们提出一个免疫编辑模型，其中抑癌基因失活与新抗原表达协同塑造肿瘤免疫监视和免疫编辑，使得相同的新抗原依遗传背景而独特地调节肿瘤免疫编辑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌症驱动突变（抑癌基因型）在肿瘤发展过程中如何影响免疫监视与免疫编辑的强度和方式。
- 核心机制
- 抑癌基因失活与新抗原表达协同塑造免疫监视：Lkb1KO肿瘤需通过沉默新抗原表达及表面呈递以逃避免疫检测，Setd2KO与Rb1KO则可在维持新抗原表达下通过其他免疫逃逸机制生长。
- 主要证据
- 在KrasLSL-G12D/+原位肺癌中结合慢病毒新抗原系列、CRISPR/Cas9体细胞编辑与Tuba-seq条形码定量；单基因敲除显示Lkb1KO强烈选择新抗原沉默，Setd2KO和Rb1KO维持mCherry-SIINFEKL表达；11个抑癌基因筛选中促生长强者对免疫监视更敏感，Trp53KO、Rbm10KO相对抵抗，Keap1KO、Arid1aKO更敏感。
- 研究意义
- 研究提示驱动突变塑造肿瘤对免疫编辑的易感性及免疫编辑发生机制，或可帮助患者选择并揭示提高免疫检查点治疗疗效的潜在治疗脆弱点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SIINFEKL介导的T细胞依赖性免疫监视
确认mCherry-SIINFEKL表达导致的新抗原沉默与生长抑制依赖T细胞。
在K;Rag1−/−与免疫健全K;Rag1+/+小鼠中比较Lenti:mCh/Cre与Lenti:mCh-SIIN/Cre起始肿瘤的大小和mCherry阳性比例。
单基因抑癌基因敲除与新抗原背景交互分析
评估Lkb1、Setd2、Rb1失活如何改变对新抗原的免疫编辑。
在K;Cas9小鼠中使用含sgRNA的Lenti:mCh/Cre或Lenti:mCh-SIIN/Cre起始肿瘤，检测肿瘤面积、mCherry IHC、H2Kb-SIINFEKL流式呈递及免疫细胞浸润。
Tuba-seq多重体内筛选
并行定量多个抑癌基因型在三种免疫原性背景下的肿瘤适应性。
构建含4nt vID、10nt肿瘤条形码和21个sgRNA的慢病毒池，转导K与K;Cas9小鼠，12周后提取肺DNA、PCR扩增vID-BC-sgRNA区域并高通量测序估算克隆肿瘤大小。
免疫逃逸调控基因与统计建模验证
验证B2M、PD-L1敲除的预期免疫效应并建立基因型-免疫交互定量模型。
比较TSWT、B2MKO、PD-L1KO在不同免疫原性背景下的相对肿瘤大小；计算相对抵抗指标并进行线性/二次拟合与bootstrap统计。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | CD45抗体 | Biolegend | 103102 |
| CD3抗体 | Abcam | ab5690 | |
| mCherry抗体 | Novus Biologicals | NBP2-25156SS | |
| LKB1抗体 | Cell Signaling | 13031S | |
| RB抗体 | Abcam | ab181616 | |
| H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| CD8抗体 | Cell Signaling | 98941S | |
| FoxP3抗体 | Cell Signaling | 12653S | |
| Ly6G抗体 | Biolegend | 127601 | |
| 精氨酸酶I抗体 | Thermo Scientific | PA5-29645 | |
| 兔ABC试剂 | Vector Laboratories | PK-4001 | |
| 大鼠ABC试剂 | Vector Laboratories | PK-6104 | |
| ImmPACT DAB显色剂 | Vector laboratories | SK-4105 | |
| 流式分析 | CD45抗体 | Invitrogen | 48-0451-82 |
| H2Kb抗体 | Biolegend | 116523 | |
| H2Kb-SIINFEKL抗体 | Biolegend | 141605 | |
| CD3抗体 | BD Pharmingen | 552774 | |
| CD4抗体 | Invitrogen | 407-0042-80 | |
| CD8抗体 | Invitrogen | 47-0081-82 | |
| CD62-L抗体 | BD Biosciences | 746726 | |
| CD44抗体 | Tonbo Biosciences | 65-0441-UO25 | |
| H2Kb-SIINFEKL四聚体 | NIH Tetramer Core Facility | -- | |
| PD-1抗体 | Invitrogen | 63-9985-80 | |
| CD39抗体 | Biolegend | 143803 | |
| LIVE/DEAD可固定活力染料Olive | Invitrogen | L34977 | |
| LIVE/DEAD可固定活力染料Near IR | Invitrogen | L34992 | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Worthington Biochemical Corp. | LS004188 |
| 中性蛋白酶 | Corning | 354235 | |
| DNA酶 | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| ACK裂红缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 细胞培养 | 含GlutaMAX的DMEM | Invitrogen | 10566016 |
| 庆大霉素 | Invitrogen | 15750060 | |
| 质粒构建 | QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| PureLink Expi无内毒素大提质粒试剂盒 | Invitrogen | A31217 | |
| BsmBI-v2限制酶 | New England Biolabs | R0739S | |
| Esp3I限制酶 | Thermo Fisher | ER0452 | |
| T7连接酶 | Enzymatics | L6020L | |
| NEB Fusion HS Flex酶及缓冲液 | New England Biolabs | M0535S | |
| MegaX DH10B T1R电感受态细胞 | Invitrogen | C640003 | |
| One Shot Stbl3化学感受态大肠杆菌 | Invitrogen | C737303 | |
| 基因组DNA提取 | DNeasy血液与组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 测序建库 | Q5热启动高保真2×预混液 | New England Biolabs | M0494X |
| AmPure XP磁珠 | Beckman Colter | A63881 | |
| MinElute凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28604 | |
| 慢病毒生产 | Opti-MEM I减血清培养基 | Invitrogen | 31985062 |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630-080 | |
| PVDF滤器 | Foxx Life Sciences | 378-3415-OEM | |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- |
| 显微成像 | Leica DMI6000B倒置光荧光显微镜 | Leica | -- |
| Leica M80紧凑型体视显微镜 | Leica | -- | |
| DNA定量 | NanoDrop OneC微量核酸蛋白测定仪 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 初始免疫原性载体系列肿瘤起始 | 病毒滴度1×10^5 PFU/只；KrasLSL-G12D/+小鼠；8、12、16周取材；每组4–5只 阅读提示：Methods Animal Studies 与 Fig. 1B、1D、1F 图注 |
| Rag1缺失验证T细胞依赖性 | K;Rag1−/−小鼠；12周取材；Lenti:mCh/Cre与Lenti:mCh-SIIN/Cre对比 阅读提示：Results 第一段末与 Fig. S1A、S1B |
| 单基因抑癌基因敲除 | 6×10^4 PFU/只；K;Cas9小鼠；sgRNA靶向Lkb1、Setd2、Rb1或非靶向；12周取材；每组n=8–10只，合并两次独立实验 阅读提示：Methods Animal Studies 与 Fig. 3B、3D、3F 图注 |
| Tuba-seq多重筛选 | K;Cas9每病毒6×10^4 PFU（共1.8×10^5 PFU/只），K小鼠每病毒1×10^5 PFU（共3×10^5 PFU/只）；K n=7，K;Cas9 n=26；12周取材；测序深度≥15细胞/read；最小肿瘤阈值100细胞 阅读提示：Methods Animal Studies、Genomic DNA Extraction for Tuba-seq、Clonal tumor size estimation 与 Fig. 5B 图注 |
| 流式检测抗原呈递与T细胞表型 | 每组小鼠数（n=3–6）；肿瘤细胞门为CD45阴性GFP阳性活单细胞；T细胞门见图S6 阅读提示：Methods Flow cytometry 与 Fig. 3G、4D、4E 图注及 Fig. S3、S6 |
| 统计与建模 | bootstrap重采样10,000次；Benjamini-Hochberg FDR校正；RANSAC剔除离群基因后拟合线性/二次模型 阅读提示：Methods 统计相关小节与 Fig. 6C、6D 图注 |