蜗牛冬眠模型建立与循环DIF发现
确认休眠可经血淋巴转移并寻找只在休眠蜗牛中出现的代谢物。
用Oreohelix subrudis蜗牛，通过限制湿度诱导aestivation；注射休眠蜗牛血淋巴；用摄像头追踪活动；HPLC-Orbitrap MS比较代谢物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
发现一种蜗牛冬眠诱导因子，通过代谢重编程和自噬在小鼠中提供类冬眠心脏保护
Discovery of a snail hibernation-inducer offering hibernation-like cardioprotection through metabolic rewiring and autophagy in mice.
实验完整度
高涵盖蜗牛在体模型、小鼠成纤维细胞/心肌细胞体外IR模型、离体灌注心脏及PDH敲除小鼠机制验证
主要模型
Oreohelix subrudis蜗牛 aestivation模型 小鼠肺成纤维细胞 小鼠心肌细胞（含Pdha1Cardiac-/-） 离体灌注小鼠心脏（Langendorff和工作心脏模型）
重点核对
SNAP工作浓度10 µM，用于蜗牛注射、细胞及离体心脏灌注 小鼠成纤维细胞缺血条件：PO2 ~50 mmHg、pH 7.35、葡萄糖2.5 mM、1% FBS，1% O2、9% CO2 小鼠心肌细胞IR：缺血3 h后复氧0.5或2 h 离体心脏protocol 2：常氧10 min，SNAP/vehicle常氧30 min，完全结扎30 min，再灌注40 min，起搏300 bpm 心肌细胞特异性Pdha1敲除：6次腹腔注射他莫昔芬50 mg/kg，8天，5周洗脱
摘要
冬眠动物通过代谢重塑和自噬实现细胞休眠，抵抗缺血和缺血再灌注（IR）损伤，而非冬眠动物则对两者均易感。本文报道在冬眠蜗牛中发现一种循环休眠诱导因子，我们对其进行了化学合成，并因其激活PHLPP1（一种调节AKT和mTORC1/S6K1的磷酸酶）而将其命名为SNail Activator of PHLPP1（SNAP）。在IR过程中，质膜PHLPP1和p-AKT转位至细胞质和线粒体，SNAP在此使线粒体p-AKT和细胞质p-S6K1去磷酸化，诱导蜗牛休眠，并在IR应激的小鼠成纤维细胞中促进自噬、可逆的细胞周期退出、蛋白质稳态和抗凋亡。在心肌细胞和灌注心脏的IR模型中，SNAP通过诱导自噬、保持丙酮酸脱氢酶（PDH）活性、防止线粒体去极化和ROS诱导的内质网应激而发挥心脏保护作用。在心肌细胞特异性PDH敲除的心脏中，SNAP的心脏保护性线粒体效应缺失。SNAP揭示了细胞应激保护的基本机制，并可能有益于供移植的正常心脏的IR损伤，这是一个重大的临床挑战。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否从冬眠蜗牛中发现循环休眠诱导因子，并利用其保守靶点PHLPP1在非冬眠小鼠中诱导类冬眠状态以抵抗缺血和IR损伤。
- 核心机制
- SNAP激活PHLPP1，使细胞质p-S6K1和线粒体p-AKT去磷酸化，抑制mTOR/S6K1并解除AKT对PDK的激活，从而保持PDH活性、促进自噬并重置AMPK/mTOR平衡。
- 主要证据
- 在蜗牛中SNAP诱导可逆休眠；在小鼠成纤维细胞和心肌细胞IR模型中促进自噬、减少凋亡和ER应激、维持ΔΨm和SRC；离体灌注心脏中改善收缩功能恢复；Pdha1Cardiac-/-中线粒体保护效应消失。
- 研究意义
- 揭示细胞应激保护的基本机制，并可能有益于供移植正常心脏的IR损伤；作者提出SNAP可加入离体灌注液，但需未来体内实验验证其他IR适应症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SNAP化学合成与结构鉴定
获得足量纯品并确认与蜗牛代谢物结构一致。
以2-(2-羟乙基)苯酚和5-乙烯基二氢-5-甲基-2(3H)-呋喃酮为起始原料合成中间体，再与三氧化硫吡啶复合物反应得SNAP吡啶鎓盐；NMR和HRMS鉴定。
SNAP靶点预测与PHLPP1激活验证
确认SNAP与PHLPP1结合并激活其磷酸酶活性。
SEA/ChEMBL预测靶点；计算机建模结合口袋；用Malachite Green assay检测合成肽HFPQFpSYSAS去磷酸化；siRNA和定点突变验证特异性。
SNAP诱导蜗牛休眠及小鼠细胞应激保护
验证SNAP能否在正常湿度下诱导蜗牛休眠，并保护燃料剥夺的小鼠细胞。
蜗牛注射10 µM SNAP并追踪活动；小鼠成纤维细胞、RASMC、HPASMC在缺血条件下给予SNAP，检测自噬、凋亡、细胞周期、蛋白质合成、线粒体功能和PDH磷酸化。
SNAP在心肌细胞IR中的线粒体与自噬机制验证
确定SNAP通过线粒体p-AKT和细胞质p-S6K1分别保护PDH和促进自噬。
分离心肌细胞亚细胞组分，免疫印迹检测PHLPP1、NHERF-1、p-AKT、p-PDK1、p-PDH；用Pdha1Cardiac-/-心肌细胞验证PDH依赖性；检测OCR/SRC、收缩力、ATP和乙酰CoA。
离体灌注心脏IR保护及PDH依赖性验证
在完整心脏水平验证SNAP的心脏保护作用及PDH的关键性。
Langendorff和工作心脏模型，protocol 1和2；记录LVP、dp/dt、心律失常恢复时间；检测TMRM、MitoSOX、乙酰CoA、乳酸和GO/FAO比率；比较αMHC-MerCreMer与Pdha1Cardiac-/-心脏。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 代谢物分析 | ARIA MX高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Velos Pro质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Xbridge BEH酰胺柱 | Waters | -- | |
| 代谢物定量 | Q Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Accela 600高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 氘代琥珀酸内标 | -- | -- | |
| SNAP合成 | Bruker FT-600核磁共振波谱仪 | Bruker BioSpin | -- |
| 5-乙烯基二氢-5-甲基-2(3H)-呋喃酮 | -- | -- | |
| 三氧化硫吡啶复合物 | -- | -- | |
| PHLPP1活性检测 | 孔雀石绿检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 12776 |
| 人重组PHLPP1 | OriGene Technologies | TP303930 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | ThermoFisher Scientific | 89900 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| ECL化学发光液 | Cytiva Amersham | 45000875 | |
| Clarity Max Western ECL底物 | Biorad | 1705062 | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads蛋白A磁珠 | Invitrogen | 10008D |
| Pierce免疫沉淀裂解液 | ThermoFisher Scientific | 87788 | |
| 共免疫沉淀 | Pierce交联磁珠免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88805 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 11995 |
| 无葡萄糖DMEM | Gibco | 11966-025 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| I型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | 11243217001 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| 2,3-丁二酮单肟 | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 13778100 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | L3000150 | |
| Opti-MEM减血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 31985070 | |
| phlpp1小干扰RNA | ThermoFisher Scientific | s23365 | |
| 活细胞成像 | 四甲基罗丹明甲酯 | ThermoFisher Scientific | T668 |
| 线粒体追踪染料 | ThermoFisher Scientific | M22426 | |
| 黄色溶酶体追踪染料 | ThermoFisher Scientific | L12491 | |
| 绿色线粒体超氧阴离子探针 | ThermoFisher Scientific | M36006 | |
| 红色线粒体超氧阴离子探针 | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| Hoechst 33342核染料 | ThermoFisher Scientific | 33342 | |
| 凋亡检测 | Annexin V Alexa Fluor 488/碘化丙啶死细胞凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher | V13241 |
| 蛋白质合成检测 | OPP蛋白质合成检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10458 |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 96992 |
| 衰老检测 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 89874 |
| 细胞组分分离 | 细胞组分分离试剂盒 | Abcam | ab109719 |
| PDH活性检测 | PDH活性检测试剂盒 | Abcam | ab109882 |
| Seahorse分析 | Seahorse XF24细胞外流量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Seahorse XF-24培养板 | Agilent Technologies | 102342100 | |
| Seahorse XF基础培养基 | Agilent Technologies | 103575-100 | |
| 离体心脏灌注 | Millar导管 | AD Instruments | -- |
| 心肌细胞分离 | 改良Langendorff灌注装置 | Harvard Apparatus | 73-4393 |
| 心肌细胞收缩力检测 | 视频边缘检测系统 | IonOptix | -- |
| 共聚焦成像 | ZEISS LSM 710共聚焦显微镜 | Carl ZEISS AG | -- |
| Zeiss LSM 900 Airyscan 2共聚焦显微镜 | Carl ZEISS AG | -- | |
| 小鼠基因型 | αMHC-MerCreMer小鼠 | Jackson Laboratory | 005657 |
| Pdha1flox小鼠 | Jackson Laboratory | 017443 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蜗牛aestivation与SNAP诱导休眠 | 蜗牛物种Oreohelix subrudis；aestivation诱导方式为移除食物和湿度；血淋巴采集前aestivation至少48 h；SNAP注射浓度10 µM；每组10只，活动追踪每1分钟，试验重复3次 阅读提示：Methods中Snail experiments、Hemolymph and SNAP injections小节及Fig. 1b、1h图注 |
| 小鼠成纤维细胞缺血模型 | 细胞来源C57BL/6J雄性16周小鼠肺组织；缺血培养基为无葡萄糖DMEM+1% FBS+2.5 mM葡萄糖；气体条件1% O2、9% CO2、PO2 ~50 mmHg、pH 7.35；SNAP 10 µM；应激72 h，恢复2天 阅读提示：Methods中Mouse fibroblast isolation and culture、SNAP treatment小节及Fig. 2a图注 |
| 小鼠心肌细胞IR模型 | 心肌细胞来源C57BL/6J雄性16周或αMHC-MerCreMer/Pdha1Cardiac-/-雄性11–12周；缺血培养基含5 mM葡萄糖、1% O2、2% CO2、PO2 ~50 mmHg；SNAP 10 µM；缺血3 h后复氧0.5或2 h 阅读提示：Methods中Cardiomyocyte isolation and culture、SNAP treatment小节及Fig. 4a、4f图注 |
| Pdha1Cardiac-/-小鼠诱导 | αMHC-MerCreMer与Pdha1flox杂交；雄性6–7周龄；他莫昔芬50 mg/kg腹腔注射6次，8天；5周洗脱后实验 阅读提示：Methods中Cardiomyocyte-specific Pdha1-deficient mice generation小节 |
| 离体灌注心脏IR | Langendorff protocol 2：常氧10 min，SNAP/vehicle常氧30 min，完全结扎30 min，再灌注40 min；起搏300 bpm；SNAP 10 µM；灌注压100 cm H2O，3–5 ml/min；工作心脏前负荷11.5 mmHg、后负荷50 mmHg 阅读提示：Methods中Isolated hearts perfusion小节及Fig. 5a图注 |