CRISPR激活筛选鉴定LRP4
寻找促进EEEV感染的宿主膜蛋白。
在A549-BAT细胞中表达dCas9-VP64，转导靶向膜蛋白启动子的sgRNA文库，接种EEEV VRP后分选mGreen阳性细胞，测序分析sgRNA富集。
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LRP4是多种致脑炎甲病毒的进入受体
LRP4 is an entry receptor for multiple encephalitic alphaviruses.
实验完整度
高CRISPR激活筛选、多种细胞系验证、原代神经元/星形胶质细胞、人脑类器官及小鼠体内保护实验，含功能与机制验证
主要模型
A549-BAT（B3GAT3/AXL/TIM-1三敲除）细胞系 K562、U-87 MG、SH-SY5Y、Huh7等细胞系 原代小鼠神经元和星形胶质细胞 人脑类器官 CD-1小鼠
重点核对
A549-BAT细胞中LRP4过表达后EEEV VRP感染率（MOI 10，8 h） LRP4敲除的SH-SY5Y和Huh7细胞中SINV-EEEV感染率（MOI 0.05/0.1，22/24 h） LRP4-LBD-Fc、LA2-Fc、LA7-Fc与EEEV VLP的结合亲和力（BLI，KD值） 小鼠体内LA2-Fc/LA7-Fc与EEEV预孵育后皮下接种（10^3 PFU，100 μg）及24 h后腹腔追加200 μg的生存率 人脑类器官中LRP4-Fc预孵育SINV-EEEV（10^4 PFU）后的病毒RNA拷贝数
摘要
致脑炎甲病毒，包括东方马脑炎病毒（EEEV），引起高死亡率的严重神经系统疾病，因此构成公共卫生威胁。尽管低密度脂蛋白受体（LDLR）家族成员，包括VLDLR、LRP8（ApoER2）和LDLR最近被鉴定为EEEV的受体，但受体缺陷细胞中的残余感染提示存在额外的进入因子。利用基于CRISPR的激活筛选，我们鉴定出LDLR相关蛋白4（LRP4）作为EEEV及几种相关甲病毒（西方马脑炎病毒、Semliki Forest病毒和Sindbis病毒）的候选进入因子。LRP4介导病毒附着和内化，其配体结合结构域直接结合病毒粒子。可溶性LRP4诱饵蛋白在原代小鼠神经元细胞、雄性小鼠和人脑类器官中有效抑制EEEV感染，提示可能的治疗应用。哺乳动物和禽类LRP4直系同源物在促进EEEV感染中表现出保守功能，支持其在其感染和传播宿主范围中的可能作用。我们的发现确立了LRP4作为多种甲病毒共享的进入受体，并扩展了我们对甲病毒嗜性、发病机制和防治措施开发的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EEEV等致脑炎甲病毒是否存在除已知LDLR家族成员外的额外进入受体，以及该受体能否作为抗病毒靶点。
- 核心机制
- LRP4通过其配体结合结构域（LBD）直接结合EEEV病毒粒子，介导病毒附着和内化，促进EEEV及WEEV、SFV、SINV等甲病毒感染。
- 主要证据
- CRISPR激活筛选鉴定LRP4；多种细胞系过表达和敲除验证感染变化；ELISA和BLI证实LRP4-LBD与EEEV VLP直接结合；可溶性LRP4-Fc在原代神经元、星形胶质细胞、人脑类器官和小鼠中抑制EEEV感染。
- 研究意义
- 确立LRP4为多种致脑炎甲病毒共享的进入受体，扩展了对甲病毒嗜性、发病机制和宿主范围的理解，并提示LRP4诱饵蛋白可能作为治疗应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因验证
验证筛选出的候选基因对EEEV感染的影响。
选取排名前11的候选基因，用两条独立sgRNA进行CRISPR激活，接种EEEV VRP后流式检测感染率。
LRP4过表达与敲除验证
确认LRP4对EEEV感染的促进作用并排除脱靶效应。
在A549-BAT、A549、K562、U-87 MG细胞中过表达HA标签LRP4，在SH-SY5Y、Huh7细胞中CRISPR敲除LRP4，接种EEEV VRP或SINV-EEEV后检测感染率；用 authentic EEEV（MADV, Brazil 1985）在K562和HAP1细胞中验证。
LRP4对其它甲病毒的作用
检测LRP4是否促进其他甲病毒感染。
在A549-BAT细胞中过表达LRP4，接种WEEV、VEEV、SFV、CHIKV VRP、GETV和SINV，流式检测感染率。
病毒结合和内化实验
确定LRP4作用于EEEV感染的进入阶段。
在LRP4过表达的A549-BAT和U-87 MG细胞中，4°C结合EEEV VRP，后转37°C内化，蛋白酶K处理去表面病毒，qRT-PCR检测病毒RNA；用SINV复制子RNA转染检测复制影响；用EEEV糖蛋白假病毒（VSVpp和MLVpp）检测进入。
LRP4功能域鉴定
确定LRP4促进EEEV感染的关键结构域。
构建LRP4缺失LBD（ΔLBD）或EGF样结构域（ΔEGF）的截短体，在A549和A549-BAT细胞中表达，接种EEEV VRP检测感染；进一步缺失单个LA重复或表达单个LA重复，以及将LBD或LA重复融合到MXRA8支架上检测。
LRP4 LBD与病毒粒子直接结合
验证LRP4 LBD与EEEV病毒粒子的直接相互作用。
用ELISA和BLI检测LRP4-LBD-Fc、单个LA-Fc与EEEV VLP的结合，并测定表观KD值；用细胞表面展示EEEV糖蛋白的HEK293T和SINV-EEEV感染的Vero CCL-81细胞检测结合。
可溶性LRP4诱饵蛋白体外阻断实验
检测LRP4-Fc蛋白对EEEV感染的抑制效果。
将LRP4-LBD-Fc、LA-Fc或对照与SINV-EEEV预孵育后感染Vero CCL-81、A549、HEK293T细胞，流式检测GFP阳性率；在原代小鼠神经元、星形胶质细胞和人脑类器官中检测抑制效果。
小鼠体内保护实验
评估LRP4-Fc诱饵蛋白对EEEV感染的体内保护效果。
将EEEV（FL93-939）与LA2-Fc、LA7-Fc或对照LDLRAD3-LA1-Fc预孵育后皮下接种CD-1小鼠，24 h后腹腔追加蛋白，监测生存和临床症状。
LRP4直系同源物功能验证
探究LRP4在跨物种传播中的潜在作用。
构建哺乳动物、鸟类和蚊虫LRP4 LBD与人LRP4其余部分的嵌合体，在A549-BAT细胞中表达，接种EEEV VRP检测感染；纯化禽类和蚊虫LRP4-LBD-Fc，BLI检测与EEEV VLP结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | -- | |
| B-27添加剂 | -- | -- | |
| GlutaMax添加剂 | -- | -- | |
| TrypLE消化液 | Thermo | 12563029 | |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | -- | -- |
| 抗HS抗体（10E4） | USBiological | H1890 | |
| 抗AXL抗体 | R&D system | MAB154-SP | |
| 抗TYRO3抗体 | R&D system | MAB859-SP | |
| 抗TIM-1抗体 | Biolegend | 353902 | |
| 抗TIM-4抗体 | Biolegend | 354002 | |
| 抗MERTK抗体 | R&D system | MAB8912-SP | |
| 小鼠IgM同型对照 | BD biosciences | 553472 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Biolegend | 401401 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Thermo | A-21235 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgM（H+L） | Thermo | A-21238 | |
| 基因编辑 | Neon转染系统 | Thermo | -- |
| EnGen sgRNA合成试剂盒 | NEB | E3322V | |
| CRISPR激活筛选 | Lenti dCas-VP64_Blast质粒 | Addgene | 61425 |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| Fugene HD转染试剂 | -- | -- | |
| pXPR_502质粒 | Addgene | 96923 | |
| CRISPR敲除 | LentiCRISPR v2质粒 | Addgene | 52961 |
| Western blot | 抗HA标签抗体 | Sigma | 05-904 |
| 抗LRP4抗体 | Thermo | MA5-27675 | |
| 抗LDLR抗体 | Proteintech | 10785-1-AP | |
| 抗LRP8抗体 | Thermo | MA5-53503 | |
| 病毒结合/内化 | 蛋白酶K | Thermo | AM2546 |
| RNA提取 | RL缓冲液 | TIANGEN | DP-430 |
| RT-qPCR | TaqMan一步法PrimeScrip RT-PCR试剂盒 | Takara | RR064A |
| 复制子实验 | mMESSAGE mMACHINE SP6试剂盒 | Thermo | AM1340 |
| 蛋白纯化 | 蛋白A层析 | Genescript | L00210 |
| Amicon 10 kDa离心过滤器 | Millipore | -- | |
| Amicon 30 kDa离心过滤器 | Millipore | -- | |
| ELISA | ELISA微孔板 | Corning | -- |
| HRP标记的抗人IgG | Promega | W4031 | |
| 细胞表面结合实验 | Alexa Fluor 647标记的山羊抗人IgG抗体 | Thermo | A-21445 |
| BLI | Octet R8生物传感器系统 | Sartorius | -- |
| ProA生物传感器 | Sartorius | 18-5010 | |
| SA生物传感器 | Sartorius | 18-5019 | |
| 类器官培养 | STEMdiff脑类器官试剂盒 | STEMCELL | 08570 |
| RNA提取（类器官） | RNA提取试剂盒 | TIAGEN | DP419 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR激活筛选 | A549-BAT细胞（B3GAT3、AXL、TIM-1三敲除）的构建和验证；sgRNA文库靶向3849个膜蛋白，每基因4条sgRNA；EEEV VRP感染MOI 10，24 h；分选mGreen阳性细胞。 阅读提示：Methods 'CRISPR activation screen'及Fig. 1A |
| LRP4过表达与敲除验证 | 不同细胞系（A549-BAT、A549、K562、U-87 MG、SH-SY5Y、Huh7）的感染MOI和时间差异；LRP4敲除效率验证；authentic EEEV（MADV, Brazil 1985）MOI 1，8 h。 阅读提示：Methods 'Gene validation by overexpression and knockout'及Fig. 1C–J |
| 病毒结合和内化实验 | EEEV VRP MOI 20，冰上结合45 min；37°C内化1 h；蛋白酶K 400 μg/mL冰上45 min；qRT-PCR引物和探针序列。 阅读提示：Methods 'Virus binding and internalization assays'及Fig. 2B–E |
| LRP4结构域鉴定 | LRP4截短体（ΔLBD、ΔEGF）和单个LA重复的氨基酸残基范围；A549细胞MOI 1，6 h；A549-BAT细胞MOI 10，8 h。 阅读提示：Methods 'LRP4 truncations and expression'及Fig. 3B–I |
| 蛋白结合实验 | ELISA中VLP包被浓度0.2 μg/mL；BLI中Fc蛋白浓度25 μg/mL，VLP浓度100 μg/mL；表观KD值由两次独立实验计算。 阅读提示：Methods 'ELISA-based binding assay'和'Biolayer interferometry (BLI)'及Fig. 4 |
| 体外阻断实验 | SINV-EEEV MOI 3，预孵育37°C 1 h；蛋白起始浓度10 μg/mL，10倍稀释；原代神经元30 μg/mL，MOI 1，6 h；星形胶质细胞10 μg/mL，MOI 3，24 h；脑类器官30 μg/mL，10^4 PFU，24 h。 阅读提示：Methods 'Soluble protein blockade assay'、'Isolation of primary mouse neurons and astrocytes and infection assay'、'Human cerebral organoid differentiation and infection assay'及Fig. 5A–H |
| 小鼠体内保护实验 | 6周龄雄性CD-1小鼠；EEEV 10^3 PFU与100 μg蛋白预孵育；足垫皮下接种；24 h后腹腔注射200 μg蛋白；每日监测临床症状、体重和生存。 阅读提示：Methods 'Mouse studies'及Fig. 5I–L |
| LRP4直系同源物功能验证 | 不同物种LRP4 LBD序列和登录号；A549-BAT细胞EEEV VRP MOI 10，8 h；BLI中EEEV VLP 200 μg/mL。 阅读提示：Methods 'Expression of LRP4 orthologs and LDLR family members'及Fig. 5M–P |