IRE1邻近互作组鉴定
鉴定UPR诱导条件下与IRE1邻近或相互作用的蛋白。
在HEK293T细胞中表达IRE1–BirA*或BirA*，加入生物素并在有无tunicamycin处理下进行BioID邻近标记，链霉亲和素pull-down后质谱鉴定。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
甘露糖基转移酶DPM1调控结直肠癌中内质网应激感受器IRE1的活性
The mannosyltransferase DPM1 regulates the activity of ER-stress sensor IRE1 in colorectal cancer.
实验完整度
高含BioID互作组、多种细胞系CRISPR敲除、皮下及原位小鼠肿瘤模型、CD8清除与ICB处理、PLA、糖基化检测及人CRC/黑色素瘤队列分析。
主要模型
CT26小鼠结肠癌细胞（BALB/c同系） MC38小鼠结肠腺癌细胞（C57BL/6同系） LLC-1小鼠Lewis肺癌细胞（C57BL/6同系） 免疫 competent 及裸鼠皮下/盲肠原位肿瘤模型
重点核对
CT26、MC38、LLC-1中Dpm1敲除克隆的蛋白缺失验证及第二sgRNA独立敲除验证 Dpm1敲除CT26皮下接种BALB/c小鼠的肿瘤生长与重量（M n=10, KO-D n=9） 抗CD8抗体100 μg/只每2天腹腔注射对Dpm1 KO抗肿瘤效应的逆转 CT26皮下模型中IRE1 RNase抑制剂MKC8866（10 mg/kg）每2天处理对Dpm1 KO保护效应的作用 IFN-γ（10 ng/ml, 24 h）诱导后PD-L1表面表达及PD-1结合检测
摘要
大多数结直肠癌（CRC）患者对免疫检查点阻断（ICB）表现出耐药性，限制了治疗效果。激活癌细胞中的未折叠蛋白反应感受器IRE1α可诱导抗肿瘤免疫反应，但其调控机制尚不清楚。本研究中，我们通过BioID筛选鉴定出长萜醇磷酸甘露糖基转移酶1（DPM1）为IRE1表达和活性的调控因子。对CRC患者RNA测序数据的分析显示，DPM1低表达与IRE1依赖性转录特征、免疫浸润增加以及ICB反应改善相关。机制上，DPM1缺失减少蛋白质糖基化，导致癌细胞中IRE1慢性激活，并增强细胞毒性T细胞介导的免疫监视。抑制或敲除IRE1可逆转这一效应。这些发现确立了DPM1作为IRE1活性调节因子影响肿瘤免疫原性，提示其作为改善癌症免疫治疗结局的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IRE1的活性与表达如何被调控，以及该调控是否影响结直肠癌的免疫监视和免疫检查点阻断应答。
- 核心机制
- DPM1缺失降低蛋白质糖基化，引起错误折叠蛋白聚集和慢性低度IRE1激活（以Xbp1剪接为主而非RIDD），同时低糖基化PD-L1经ERAD和溶酶体途径降解；IRE1激活部分贡献于PD-L1下调及抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- BioID和PLA证实DPM1与IRE1在UPR诱导下邻近互作；多种细胞系Dpm1 KO显示糖基化降低、IRE1寡聚化与Xbp1剪接增加、PD-L1下降；小鼠肿瘤模型显示Dpm1 KO以CD8+ T细胞依赖方式抑制肿瘤生长，IRE1抑制或双敲除削弱该效应；人CRC和黑色素瘤队列显示DPM1低表达与CD8+ T细胞浸润增加及ICB应答改善相关。
- 研究意义
- 将DPM1确立为连接ER蛋白稳态与免疫检查点稳定性的调控因子，提示DPM1表达可能作为免疫治疗应答的生物标志物，并提示诱导慢性和非急性ER应激的UPR调节策略可能增强免疫冷肿瘤对免疫治疗的敏感性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因体内筛选
验证BioID候选基因敲除对肿瘤生长的影响。
用非整合CRISPR/Cas9 nanoblades在CT26细胞中敲除Ufl1或Dpm1，皮下接种免疫 competent BALB/c小鼠，监测肿瘤生长；并将Dpm1 KO CT26细胞原位接种盲肠。
DPM1–IRE1互作验证
独立验证DPM1与IRE1在UPR诱导下的邻近互作。
在CT26 MOCK和Dpm1 KO细胞中进行PLA，检测内源性IRE1–DPM1相互作用，比较未处理与tunicamycin处理。
DPM1表达与人类免疫浸润及ICB应答关联分析
分析DPM1表达与CRC免疫特征及免疫治疗应答的关系。
分析63例CRC患者单细胞RNA-seq、TCGA COAD bulk RNA-seq、MSS CRC phase 1b/2试验及黑色素瘤ICB队列中DPM1表达与免疫浸润和应答的关系。
CD8+ T细胞依赖性与免疫微环境分析
确定Dpm1 KO抗肿瘤效应是否依赖适应性免疫及CD8+ T细胞。
在CT26、MC38、LLC-1模型中用抗CD8抗体清除CD8+ T细胞，并在裸鼠中接种Dpm1 KO细胞；用光谱流式分析肿瘤免疫浸润，并进行离体T细胞杀伤实验和再挑战实验。
糖基化缺陷与PD-L1降解机制分析
解析DPM1缺失如何影响蛋白糖基化及PD-L1稳定性。
用凝集素染色、HaloTag报告系统、Western blot、ENDO H/PNGase F处理、MG132和bafilomycin A1处理及LysoTracker检测分析糖基化和PD-L1降解途径。
IRE1激活及UPR分支分析
确定Dpm1 KO是否选择性激活IRE1分支及其激活方式。
用RT-qPCR、Western blot、native gel检测IRE1表达、Xbp1剪接、寡聚化及PERK/ATF6分支，并用PROTEOSTAT检测蛋白聚集。
IRE1对DPM1缺失表型的贡献验证
验证IRE1激活在DPM1缺失诱导的抗肿瘤免疫和PD-L1调控中的作用。
在CT26和MC38中构建DPM1/IRE1单敲和双敲细胞，检测糖基化和PD-L1；在CT26皮下模型中用MKC8866抑制IRE1；在LLC-1模型中联合抗PD-1和抗CTLA-4治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白互作与邻近关系
验证细胞功能与免疫效应
验证分子表达与翻译后修饰
评估体内肿瘤生长与治疗效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 61870-010 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140.122 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 31966-021 | |
| CRISPR/Cas9敲除 | Cas9-MLV-gag编码质粒（BicCas9） | -- | -- |
| BaEVRless包膜质粒 | -- | -- | |
| VSV-G包膜质粒 | -- | -- | |
| MLV gag-pol质粒 | -- | -- | |
| DPM1回补 | mDpm1慢病毒表达载体 | VectorBuilder | VB900002-2967sue |
| BioID | 中性亲和素偶联珠 | -- | -- |
| 衣霉素 | -- | -- | |
| 生物素 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Santa Cruz | sc-24948 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Amersham ECL Prime Western blot检测试剂 | Cytiva | RPN2236 | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare, Life Science | -- | |
| ATF6检测转染 | jetOPTIMUS DNA转染试剂 | Polyplus | 101000025 |
| 去糖基化处理 | PNGase F | New England BioLabs | P0704S |
| Endo H | New England BioLabs | P0702L | |
| Western blot | DPM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515721 |
| PD-L1抗体 | Abcam | ab213480 | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| XBP1抗体 | BioLegend | 658802 | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815 | |
| PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192 | |
| FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| HSP90抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13119 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| HRP偶联抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| HRP偶联抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| RT-qPCR | Omniscript逆转录试剂盒 | Qiagen | 205113 |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4367659 | |
| Step One实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| HaloTag检测 | HaloTag Oregon Green配体 | Promega | G2801 |
| MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 蛋白聚集检测 | PROTEOSTAT蛋白聚集检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | ENZ-51035-K100 |
| PLA | Duolink原位红色起始试剂盒（鼠/兔） | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 流式分析 | LysoTracker Red DND-99 | Thermo Fisher Scientific | L7528 |
| 抗小鼠PD-L1抗体 | Biolegend | 124315 | |
| 固定试剂盒 | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| PD-1/PD-L1结合检测 | 重组小鼠PD-1 (CD279)-Fc嵌合体 | Biolegend | 764806 |
| PE偶联F(ab’)2山羊抗人Fc | Biolegend | 398004 | |
| 流式分析 | Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek | -- |
| 动物实验 | 抗CD8清除抗体 | Bioxcell | BE0004-1 |
| 抗PD-1阻断抗体 | Biolegend | 135248 | |
| 抗CTLA-4阻断抗体 | Bioxcell | BX-BE0164 | |
| 单细胞TCR分析 | Fc阻断剂（克隆2.4G2） | BD Pharmingen | -- |
| FITC-TCRB（克隆H57-597） | BD Pharmingen | -- | |
| PE-CD4（克隆RM4-5） | BD Pharmingen | -- | |
| PE-CD8（克隆53-6.7） | BioLegend | -- | |
| APC-CD3（克隆145-2C11） | Invitrogen | -- | |
| TotalSeqC Hashtag（#1–8）抗体（克隆M1/42; 30F11） | BioLegend | -- | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞5′试剂盒v.2 | 10x Genomics | 1000265 |
| 组织解离 | 胶原酶/透明质酸酶 | STEMCELL Technologies | 07912 |
| DNase I溶液 | STEMCELL Technologies | 100-0762 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肿瘤模型 | 细胞接种数量与体积：CT26 1×10^6/100 μl皮下，MC38和LLC-1 0.5×10^6/100 μl皮下；盲肠原位CT26 1×10^6/10 μl（70% DMEM+30% Matrigel）；小鼠品系与性别年龄：5周龄雌性BALB/c、C57BL/6及裸鼠。 阅读提示：Methods Animals小节及Fig. 1b–d、Fig. 2d–h图注。 |
| CD8+ T细胞清除 | 抗体剂量与给药频率：100 μg/只每2天腹腔注射，持续2周；对照为PBS；清除效率验证：文中未明确说明。 阅读提示：Methods Animals小节及Fig. 2d–f图注。 |
| IRE1抑制剂处理 | MKC8866剂量与频率：10 mg/kg每2天；给药途径：文中未明确说明；对照：DMSO。 阅读提示：Fig. 7c图注。 |
| 免疫检查点阻断 | 抗PD-1和抗CTLA-4各10 mg/kg每3天腹腔注射，从肿瘤接种第5天后开始；对照为PBS。 阅读提示：Methods Animals小节及Fig. 7b图注。 |
| PD-L1表达与结合检测 | IFN-γ刺激浓度与时间：10 ng/ml处理24 h；PD-L1抗体浓度1:200；PD-1-Fc浓度10 μg/ml。 阅读提示：Methods Flow cytometry analysis小节及Fig. 5b–d图注。 |
| 糖基化检测 | 凝集素染色浓度与时间：生物素化凝集素4°C孵育30 min，荧光链霉亲和素4°C孵育30 min；HaloTag配体1:1000、37°C 15 min。 阅读提示：Methods Flow cytometry analysis和HaloTag ligand detection小节及Fig. 4a–e图注。 |
| Dpm1敲除验证 | sgRNA序列：sgRNA1 5’- CTCTGGAACTCGATACAAG −3’，sgRNA2 5’- GTGGAATCAAACACGCCACG −3’；敲除效率通过Western blot验证；第二sgRNA独立敲除用于排除脱靶。 阅读提示：Methods Generation of CRISPR/Cas9 cells and rescued cells小节及Supplementary Fig. 7d, e。 |