建立KRASi敏感与耐药结直肠癌模型
评估结直肠癌对pan-KRAS抑制剂的治疗脆弱性并筛选耐药模型。
从原发CRC标本建立22例PDO，并用商业CRC细胞系进行IC50和p-ERK检测；通过慢性药物暴露建立获得性耐药细胞系和类器官。
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增强子重塑驱动的甲羟戊酸途径重编程赋予结直肠癌对KRAS抑制剂耐药性
Mevalonate pathway rewiring driven by enhancer remodelling confers resistance to KRAS inhibitors in colorectal cancer.
实验完整度
高含22例CRC类器官、多种细胞系、异种移植和PDX模型，并整合ChIP-seq、RNA-seq、WES及功能与机制验证。
主要模型
22例结直肠癌患者来源类器官（PDOs） 商业结直肠癌细胞系（如LS174T、DLD1、GP2D、SW837等） LS174T-R、SW837-R等获得性耐药细胞系及CRC5-R耐药类器官 LS174T-R、SW837-R及PDX-CRC15、PDX-CRC16异种移植模型
重点核对
PDO和细胞系对BI-2865的IC50阈值（≤5 μM为敏感，>5 μM为耐药）及96 h药物暴露 BI-2865处理后p-ERK动态（2 h抑制与24 h反弹）的免疫印迹验证 H3K27ac和H3K4me3的ChIP-seq/ChIP-qPCR增强子重塑分析 HMGCR、FDPS等MVA通路基因敲低或他汀/FTI/GGTI抑制剂处理对p-ERK和耐药表型的影响 LS174T-R和PDX-CRC15异种移植中BI-2493与瑞舒伐他汀联合的肿瘤生长及Ki-67/p-ERK检测
摘要
KRAS抑制剂（KRASi）已成为治疗KRAS突变癌症的有前景的新型癌症疗法；然而，耐药性仍然是一个潜在的临床挑战。在此，我们证明ERK再激活是KRASi耐药结直肠癌（CRC）的一个标志，并进一步证明增强子重塑通过甲羟戊酸（MVA）途径重编程胆固醇生物合成以赋予这种耐药性。机制上，增强子重塑激活MVA途径，该途径促进KRAS向膜的运输，并在KRAS抑制的情况下维持MAPK信号传导。使用他汀类药物对MVA途径进行药理学抑制，有效阻断KRAS定位到细胞膜，克服CRC中的KRASi耐药性。总之，这些发现确定了胆固醇生物合成的表观遗传-代谢偶联作为KRASi耐药的一种机制，并突出了KRAS突变CRC中可靶向的代谢脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌对pan-KRAS抑制剂产生耐药的分子机制是什么，以及能否通过靶向相关代谢途径克服耐药？
- 核心机制
- 增强子重塑激活甲羟戊酸（MVA）途径，促进KRAS法尼基化及膜转运，从而在KRAS抑制下维持ERK磷酸化和MAPK信号，赋予KRASi耐药。
- 主要证据
- 在22例CRC类器官和多种细胞系中，耐药模型显示p-ERK反弹；ChIP-seq/RNA-seq揭示胆固醇生物合成上调；HMGCR/FDPS敲低或他汀、FTI处理可抑制KRAS膜定位和p-ERK并恢复敏感性；LS174T-R和PDX模型验证联合治疗抑瘤。
- 研究意义
- 识别胆固醇生物合成的表观遗传-代谢偶联作为KRASi耐药机制，并提供将他汀与KRASi联合以增强疗效和克服耐药的临床转化策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ERK再激活与耐药表型
确定ERK信号反弹是否与KRASi耐药相关。
在敏感和耐药PDO及细胞系中进行剂量和时间依赖的p-ERK免疫印迹，并用ERK-KTR报告系统监测ERK活性动态。
解析增强子重塑和转录组变化
探究耐药是否由表观遗传重塑驱动。
对LS174T-P和LS174T-R进行H3K27ac和H3K4me3 ChIP-seq及RNA-seq，整合分析增强子变化与基因表达。
验证MVA通路及KRAS法尼基化功能
确定MVA通路及其介导的KRAS法尼基化在耐药中的作用。
敲低HMGCR、FDPS、SQLE、DHCR7，并使用他汀、FTI-277、GGTI-2418、terbinafine、BIBB-515及MVA中间产物处理，检测p-ERK、集落形成和KRAS膜定位。
体内验证他汀与KRASi联合疗效
评估联合治疗在动物模型中的抗肿瘤效果和安全性。
在LS174T-R、SW837-R、PDX-CRC15和PDX-CRC16异种移植模型中比较vehicle、KRASi、瑞舒伐他汀及联合组的肿瘤生长和IHC指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | BI-2493 | Targetmol | T72061 |
| BI-2865 | Hi-Future | HF04235 | |
| 索托拉西布 | Targetmol | T8684 | |
| THZ1 | Targetmol | T3664 | |
| YKL-5-124 | Targetmol | T22461 | |
| samuraciclib | Targetmol | T61835 | |
| JQ-1 | Targetmol | T2110 | |
| 瑞舒伐他汀钙 | Targetmol | T1510 | |
| FTI-277 | Targetmol | T62675 | |
| GGTI-2418 | Targetmol | T11396 | |
| 特比萘芬 | Targetmol | T6702 | |
| BIBB-515 | Targetmol | T4039 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| 类器官培养 | TrypLE Express酶 | Gibco | 12604013 |
| 凋亡检测 | Annexin V–FITC凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 流式分析 | 光谱细胞分析仪SP6800Z | Sony | -- |
| 膜/胞质蛋白分离 | 细胞膜蛋白和胞质蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0033 |
| 胆固醇检测 | Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0211S |
| ChIP | H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 |
| H3K4me3抗体 | EMD Millipore | 07-473 | |
| 蛋白G Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| ChIP-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| ChIP-seq建库 | NEBNext ChIP-Seq文库构建预混液套装 | New England Biolabs | -- |
| ChIP-seq | Illumina HiSeq 2500测序系统 | Illumina | -- |
| RNA-seq | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| TruSeq链特异性RNA HT试剂盒 | Illumina | -- | |
| Novaseq S6000测序系统 | Illumina | -- | |
| qRT-PCR | PerfectStart Green qPCR预混液 | TransGen Biotech | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Roche | -- |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| ECL蛋白质印迹检测试剂 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RAS-GTP pulldown | KRAS抗体 | Santa Cruz | sc-517599 |
| HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| NRAS抗体 | Proteintech | 10724-1-AP | |
| 免疫荧光 | DAPI | MIKX | CE378 |
| Nikon AX/AX R NSPARC共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| ERK-KTR细胞系构建 | pLentiCMV Puro DEST ERKKTRClover质粒 | Addgene | 59150 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAi-MAX | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDO药物敏感性检测 | PDO来源、KRAS突变类型、BI-2865浓度梯度、96 h处理时间、ATP活力检测及IC50≤5 μM敏感阈值 阅读提示：Results 'In vitro effects of pan-KRAS inhibitors in preclinical CRC models'及Fig. 1d；Methods 'Patient Samples'和'Cell viability assay' |
| p-ERK动态检测 | BI-2865处理浓度（2 h剂量梯度或5 μM时间梯度）、免疫印迹独立实验重复数n=3 阅读提示：Fig. 1f–i、Fig. 2b–c、Fig. 2k–l图注及Methods 'Immunoblotting and immunoprecipitation' |
| 增强子重塑分析 | LS174T-P与LS174T-R细胞、H3K27ac/H3K4me3抗体货号、ChIP-seq重复数n=1、RNA-seq重复数n=2及差异分析阈值 阅读提示：Fig. 3a–e图注、Methods 'ChIP-Seq'、'ChIP-Seq data analysis'和'RNA-Seq and data analysis' |
| MVA通路功能验证 | HMGCR/FDPS/SQLE/DHCR7敲低效率、他汀20 μM、FTI-277 5 μM、GGTI-2418 5 μM、MVA 100 μM、FPP 2 μM、GGPP 2 μM等浓度及BI-2865处理浓度 阅读提示：Fig. 4b–l图注及Results 'The mevalonate pathway-driven protein farnesylation promotes pan-KRASi resistance in CRC' |
| 体内联合治疗实验 | 小鼠品系与周龄（雌性BALB/c nude和NOD/SCID，5–6周龄）、细胞接种数量、给药剂量与途径、每组样本量、随机分组和肿瘤体积终点 阅读提示：Methods 'Animal experiments'及Fig. 6a–d、Fig. 7k、n、q图注 |