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        LTBP4缺失抑制心肌细胞中NLRP3炎症小体激活并减轻雄性小鼠心力衰竭

        LTBP4 deficiency inhibits NLRP3 inflammasome activation in cardiomyocytes and attenuates heart failure in male mice.

        作者信息Siyu Ma, Nan Jiang, Zheng Zuo, Zhipeng Lian, Jian Wu, Jinghua Ma, Xiangxiang Wei, Yunquan He, Qi Pan, Jiayi Lin, Yongbo Li, Yannan Hou, Xiuling Zhi, Xiaobo Li, Elena Osto, Yuxiang Dai, Jun Li, Jieyu Guo, Dan Meng
        PMID42140931
        期刊Nat Commun
        发布时间2026-05-15
        DOI10.1038/s41467-026-73125-w
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含患者样本、snRNA-seq、多种细胞模型及心肌细胞特异性敲除小鼠TAC模型，并有功能与机制验证

        主要模型

        HFrEF患者左心室组织和血浆样本 心肌细胞特异性Ltbp4诱导性敲除小鼠（Ltbp4cko）及Ltbp4fl/fl对照小鼠TAC模型 新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和新生小鼠心肌细胞（NMCMs） H9C2、HEK293T和U2OS细胞系

        重点核对

        TAC模型：雄性小鼠10–12周龄，TAC后14天和28天行超声心动图，28天取材，每组n=6 细胞处理：NRCMs用AngII 0、1、10、50、100 μM处理，H2O2 200 μM处理6 h，每组n=4–6生物学重复 心肌细胞特异性敲除：他莫昔芬30 mg/kg隔日腹腔注射共4次 SP1抑制：Plicamycin 0.4 mg/kg隔日腹腔注射共6次（TAC前2次、TAC后4次） NLRP3抑制：MCC950 10 μM处理，每组n=4–6生物学重复

        摘要

        潜伏转化生长因子β结合蛋白4（LTBP4）已被报道与心力衰竭（HF）相关，但其在HF中的作用仍不清楚。我们观察到HF患者血浆和心肌细胞中LTBP4表达增加，在横向主动脉缩窄（TAC）诱导的雄性小鼠HF模型中也是如此。心肌细胞特异性Ltbp4缺失减轻了TAC后的NLRP3炎症小体激活、心功能障碍和纤维化。机制上，压力超负荷部分通过转录因子SP1上调LTBP4。血管紧张素II通过动力蛋白促进细胞内LTBP4募集至微管组织中心（MTOC）。随后，LTBP4促进动力蛋白介导的NLRP3向MTOC的易位，并促进NLRP3-NEK7相互作用，从而驱动NLRP3炎症小体激活。此外，LTBP4上调NLRP3转录，并与HF患者中的NLRP3和白细胞介素-1β呈正相关。本研究表明，LTBP4是心肌细胞中NLRP3-NEK7相互作用和NLRP3炎症小体激活的重要调节因子，突显其作为HF治疗靶点的潜力。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        LTBP4是否参与心力衰竭进展及其在心肌细胞NLRP3炎症小体激活中的作用和分子机制。
        核心机制
        压力超负荷部分通过SP1上调LTBP4；AngII通过动力蛋白促进细胞内LTBP4募集至MTOC，LTBP4与DYNLT1结合并促进动力蛋白介导的NLRP3向MTOC易位，增强NLRP3与NEK7相互作用，从而驱动NLRP3炎症小体激活；LTBP4还上调NLRP3转录。
        主要证据
        HFrEF患者样本和TAC小鼠中LTBP4表达升高；心肌细胞特异性Ltbp4缺失减轻TAC后NLRP3炎症小体激活、心功能障碍和纤维化；NRCMs/H9C2中LTBP4敲低或过表达改变NLRP3和Cleaved-CASP1水平；co-IP和GST pull-down证实LTBP4与NLRP3、NEK7、DYNLT1相互作用，LTBP4 1574-1624aa区域对结合NEK7至关重要。
        研究意义
        LTBP4被确定为心肌细胞中NLRP3-NEK7相互作用和NLRP3炎症小体激活的重要调节因子，提示其作为心力衰竭治疗靶点的潜力。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        LTBP4在HF患者和TAC小鼠中的表达验证

        验证LTBP4是否在心力衰竭中表达升高并定位至心肌细胞。

        检测HFrEF患者左心室LTBP4蛋白、血浆LTBP4水平，TAC小鼠左心室LTBP4 mRNA和蛋白，免疫荧光共定位LTBP4与CTNT，并分析snRNA-seq数据集。

        2

        SP1介导压力超负荷诱导的LTBP4转录

        探究TAC和AngII诱导LTBP4表达升高的转录机制。

        JASPAR数据库motif分析；NRCMs中转染Sp1 siRNA并给予AngII；TAC小鼠给予SP1抑制剂Plicamycin；检测LTBP4和SP1表达。

        3

        心肌细胞特异性Ltbp4敲除对TAC诱导心力衰竭的影响

        验证心肌细胞LTBP4缺失是否减轻心功能障碍和纤维化。

        构建Myh6-CreERT2-Ltbp4fl/fl（Ltbp4cko）小鼠，他莫昔芬诱导敲除，10–12周龄雄性小鼠行TAC，超声心动图评估心功能，Masson、Picrosirius red和POSTN免疫荧光评估纤维化，qRT-PCR检测Col1a1和Col3a1。

        4

        LTBP4缺失对NLRP3炎症小体信号通路的影响

        探究LTBP4缺失保护心脏功能的潜在机制。

        对TAC后Ltbp4cko和Ltbp4fl/fl小鼠心脏行RNA-seq和GO分析；ELISA检测血浆IL-1β；qRT-PCR检测Casp1、Il-1β、Il-18、Nlrp3；Western blot检测NLRP3、Cleaved-CASP1、COL1A1、α-SMA；CD45免疫荧光检测炎症细胞浸润。

        5

        LTBP4在心肌细胞中激活NLRP3炎症小体并加剧细胞死亡

        验证LTBP4对心肌细胞NLRP3通路和细胞死亡的特异性作用。

        NRCMs和NRCFs给予AngII或PE；NRCMs转染Ad-shLtbp4或Ad-LTBP4；H9C2细胞给予H2O2；Calcein-AM染色和LDH释放检测细胞死亡；CHX检测NLRP3蛋白稳定性；MCC950抑制NLRP3。

        6

        细胞内LTBP4激活NLRP3炎症小体信号通路

        确定LTBP4通过细胞内形式还是分泌形式激活NLRP3通路。

        构建信号肽缺失的LTBP4腺病毒（Ad-LTBP4Δ2-27aa），在NRCMs中比较其与全长LTBP4对NLRP3、Cleaved-CASP1和H2O2诱导细胞死亡的影响。

        7

        LTBP4与NLRP3、NEK7和DYNLT1的相互作用验证

        阐明LTBP4调控NLRP3炎症小体激活的分子机制。

        BioGRID数据库分析；co-IP验证LTBP4与NLRP3、NEK7、DYNLT1相互作用；GST pull-down验证LTBP4与NLRP3直接结合；免疫荧光共定位；免疫共沉淀-质谱鉴定LTBP4相互作用蛋白；LTBP4截短体定位NEK7结合区域。

        8

        LTBP4促进NLRP3与NEK7相互作用及炎症小体组装

        验证LTBP4是否促进NLRP3-NEK7结合和NLRP3炎症小体组装。

        HEK293T细胞共转染LTBP4-FLAG、NLRP3-MYC和NEK7-HA行co-IP；U2OS细胞免疫荧光检测NLRP3-NEK7共定位；Ltbp4cko小鼠TAC后心脏co-IP检测NLRP3-NEK7相互作用；NRCMs中检测LTBP4过表达对NLRP3向MTOC易位及NLRP3-Pro-CASP1相互作用的影响；Ad-LTBP4Δ3（缺失1574-1624aa）功能验证。

        9

        HFrEF患者中LTBP4与NLRP3和IL-1β的相关性分析

        在临床样本中验证LTBP4与NLRP3炎症小体的关系。

        HFrEF患者心脏组织免疫荧光检测LTBP4和NLRP3共定位；血浆LTBP4与IL-1β相关性分析；GEO数据集GSE84796中LTBP4与NLRP3表达相关性分析。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        超声心动图Masson三色染色天狼星红染色免疫荧光染色酶联免疫吸附测定
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时定量PCRRNA测序单核RNA测序分析
        验证细胞功能变化
        钙黄绿素-AM染色LDH释放实验放线菌酮追踪实验
        验证机制链路
        免疫共沉淀GST pull-down实验免疫沉淀-质谱分子对接分析质粒转染腺病毒感染
        数据分析与统计
        基因本体富集分析京都基因与基因组百科全书通路分析Spearman相关性分析Kaplan-Meier生存分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养Dulbecco改良Eagle培养基Life technologies12800082
        胎牛血清Gbico10099-141
        II型胶原酶Life technologies17101015
        牛血清白蛋白Yeasen36101ES25
        0.25%胰蛋白酶-EDTAGibco25200072
        青霉素/链霉素BeyotimeC0222
        动物实验他莫昔芬MCEHY-13757A
        药物处理血管紧张素IIMCEHY-13948
        尼日利亚菌素MCEHY-127019
        过氧化氢Sigma-Aldrich88597
        MCC950MCEHY-12815
        Ciliobrevin AMCEHY-100790
        普卡霉素----
        Western blot蛋白酶抑制剂混合物MCEHY-K0010
        免疫荧光4',6-二脒基-2-苯基吲哚Sigma-AldrichD9542-1MG
        Triton X-100Sigma-AldrichT9284
        驴血清Jackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
        RNA提取Trizol试剂Vazyme BiotechR401-01
        RT-qPCRReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒ToyoboFSQ-101
        ChamQ通用SYBR qPCR预混液Vazyme BiotechQ711
        质粒转染Lipofectamine 3000转染试剂GbicoL3000075
        Opti-MEM培养基Gbico31985088
        jetPEI转染试剂Polyplus-transfection SA24765-1
        免疫共沉淀Protein A/G PLUS琼脂糖珠SantacruzSC-2003
        抗DYKDDDDK G1亲和树脂GenScriptL00432
        抗HA Nanoab琼脂糖珠EverylabIP07
        抗MYC Nanoab琼脂糖珠EverylabIP08
        Western blot抗NLRP3抗体Cell Signaling15101T
        免疫共沉淀抗NEK7抗体Abcamab133514
        免疫荧光抗心肌肌钙蛋白T抗体Abcamab8295
        抗LTBP4抗体AbmartPHY6049
        抗NLRP3抗体Proteintech68102-1-Ig
        抗POSTN抗体Proteintech19899-1-AP
        抗FLAG抗体Proteintech66008-4-Ig
        抗HA抗体huaxingbioHX1820
        抗CMYC抗体ACE BiotechnologyBP0001-01
        FLAG-488GenScriptA01809
        Alexa Fluor 488标记抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratories715-545-150
        Alexa Fluor 488标记抗兔Jackson ImmunoResearch Laboratories711-545-152
        Alexa Fluor 594标记抗小鼠Jackson ImmunoResearch Laboratories715-585-150
        Alexa Fluor 594标记抗兔Jackson ImmunoResearch Laboratories711-585-152
        Alexa Fluor 647标记抗兔Jackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
        组织染色Masson三色染色试剂盒Yeasen60532ES74
        天狼星红染色试剂盒SolarbioG1472
        细胞活力检测钙黄绿素-AMBeyotimeC2012
        细胞死亡检测LDH释放试剂盒MCEHY-K1090
        ELISA人LTBP4 ELISA试剂盒ABclonalRK11421
        小鼠LTBP4 ELISA试剂盒Uping BioSYP-M2169
        人IL-1β ELISA试剂盒HuabioEH0006
        小鼠IL-1β ELISA试剂盒ABclonalEM0001
        超声心动图Vevo 3100超声成像系统FUJIFILM VisualSonics Inc.30 MHz, 450 probes
        Western blotTanon-5200成像系统Tanon Science & Technology Ltd--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        TAC小鼠模型
        小鼠性别、周龄、TAC狭窄针头规格、观察时间点、样本量
        阅读提示：Methods中Transverse aortic constriction (TAC) model小节及Fig. 2B图注
        心肌细胞特异性Ltbp4敲除
        他莫昔芬剂量、给药频率、注射次数、敲除验证方法
        阅读提示：Methods中Animals小节和Transverse aortic constriction (TAC) model小节
        细胞刺激与抑制剂处理
        AngII、PE、H2O2、Nigericin、MCC950、CilioA、CHX的浓度和处理时间
        阅读提示：Methods中Cell culture小节及各Figure图注
        腺病毒转染
        病毒MOI、转染时间、对照病毒类型
        阅读提示：Methods中Virus infection小节
        co-IP与GST pull-down
        抗体用量、孵育时间、洗涤条件、截短体构建
        阅读提示：Methods中Immunoprecipitation and western blotting及Glutathione s-transferase (GST) pull-down assays小节，Fig. 6和Fig. 7图注

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