全基因组CRISPR筛选鉴定抗原呈递调控基因
筛选DC中调控抗原呈递的内在基因，寻找负向调控因子。
用GeCKO v2小鼠CRISPR敲除文库感染MutuDC，嘌呤霉素筛选后OVA处理，分选pMHC-I高表达细胞进行sgRNA测序，并结合MutuDC转录组测序分析候选基因；对前35个基因进行二次siRNA功能筛选。
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树突状细胞中ERα的阻断增强抗原交叉呈递并诱导抗肿瘤CD8+ T细胞免疫
ERα blockade in dendritic cells enhances antigen cross-presentation and induces antitumor CD8+ T cell immunity.
实验完整度
高全基因组CRISPR筛选、小鼠DC细胞系与条件敲除小鼠、人MoDC、多种肿瘤模型体内验证及机制验证
主要模型
MutuDC与DC2.4小鼠DC细胞系 Esr1fl/fl-Itgax-cre条件敲除小鼠来源Flt3L-DC及脾脏cDC1/cDC2 MC38、MC38-OVA与B16-OVA皮下肿瘤小鼠模型 人单核细胞来源DC（MoDC）与CMV PP65特异性T细胞
重点核对
GeCKO v2文库感染MutuDC的MOI为0.3，嘌呤霉素0.3 μg/ml筛选6天，OVA 3 mg/ml处理48 h后分选pMHC-I高表达前1%细胞 Esr1缺失验证：siRNA敲低、CRISPR/Cas9敲除DC2.4及Esr1fl/fl-Itgax-cre小鼠条件敲除 DC与T细胞共培养：OVA预处理浓度3 mg/ml或100 μg/ml，B3Z共培养12 h，OT-1 CD8+ T细胞共培养16-48 h 体内DC疫苗：MC38-OVA 2×10^6或B16-OVA 5×10^5细胞接种，第6、16天瘤内注射5×10^5 DC；ERD-6预处理BMDC于第7、14、21天静脉注射2×10^6细胞 人MoDC：Elacestrant 100 nM处理48 h，PP65蛋白10 μg/ml脉冲12 h后与自体T细胞共培养
摘要
树突状细胞（DC）功能障碍会阻碍抗肿瘤免疫，因此了解DC抗原呈递的内在调控因子以及由此产生的抗肿瘤CD8+ T细胞激活，可能有益于治疗。在此，我们利用全基因组CRISPR筛选DC中调控抗原呈递的基因，并鉴定出雌激素受体α（ERα）是抑制抗原交叉呈递的内在检查点。ERα的基因组缺失或药理学降解可增强小鼠和人DC中的抗原呈递及CD8+ T细胞致敏。在机制上，ERα不依赖经典雌激素信号通路，维持Galectin-3介导的CHMP4b向受损吞噬体的募集，从而促进ESCRT-III介导的膜修复并限制胞质抗原转位。在体内，ERα缺陷或ERα降解的DC疫苗可扩增肿瘤特异性CD8+ T细胞，从而抑制皮下癌症小鼠的肿瘤生长。在体外，FDA批准的ERα拮抗剂增强人DC介导的抗原特异性人CD8+ T细胞激活。因此，我们的工作揭示了ERα在吞噬体完整性中的非经典作用，作为DC中抗原交叉呈递的检查点，并提示靶向ERα的DC疫苗作为一种潜在的免疫治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DC中调控抗原交叉呈递的内在分子检查点是什么，以及靶向该检查点能否增强DC介导的抗肿瘤CD8+ T细胞免疫。
- 核心机制
- ERα不依赖经典雌激素信号，维持Galectin-3介导的CHMP4b向受损吞噬体募集，促进ESCRT-III介导的膜修复，从而限制抗原从吞噬体向胞质转位并抑制交叉呈递。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选及二次siRNA筛选鉴定Esr1；小鼠DC细胞系、条件敲除小鼠DC和人MoDC中ERα缺失或降解增强抗原呈递与CD8+ T细胞激活；MC38、MC38-OVA和B16-OVA肿瘤模型中ERα缺陷或降解DC疫苗抑制肿瘤生长；IP-MS、Co-IP和pull-down支持ERα-Galectin-3-CHMP4b相互作用。
- 研究意义
- 揭示ERα在吞噬体完整性中的非经典作用及其作为DC抗原交叉呈递检查点的功能，提示靶向ERα的DC疫苗可作为潜在的免疫治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ERα对DC抗原呈递和CD8+ T细胞激活的调控
验证Esr1/ERα缺失是否增强DC抗原呈递及CD8+ T细胞激活。
在MutuDC、DC2.4及Esr1fl/fl-Itgax-cre小鼠来源Flt3L-DC、脾脏cDC1/cDC2中敲低或敲除Esr1，检测pMHC-I表达、B3Z报告细胞β-半乳糖苷酶活性、OT-1 CD8+ T细胞CFSE稀释和IFN-γ分泌，以及pMEL CD8+ T细胞对B16-F10抗原的响应。
评估ERα缺陷或降解DC疫苗的体内抗肿瘤效果
评估靶向ERα的DC疫苗是否增强体内抗肿瘤免疫。
在Esr1fl/fl-Itgax-cre与对照小鼠中建立MC38皮下肿瘤模型，检测肿瘤生长和瘤内CD8+ T细胞IFN-γ；在MC38-OVA和B16-OVA模型中瘤内注射Esr1沉默Flt3L-DC；在MC38模型中静脉回输ERD-6预处理的肿瘤裂解物脉冲BMDC疫苗。
确定ERα调控抗原交叉呈递的具体阶段
判断ERα是否影响肽段呈递、抗原摄取、吞噬体降解或抗原向胞质释放。
用短肽OVA257-264、OVA-AF647摄取、DQ-OVA降解、外源细胞色素c诱导凋亡、OVA-AF647与LAMP-1共定位及β-lactamase/CCF4实验检测抗原从吞噬体向胞质转位。
解析ERα-Galectin-3-ESCRT-III膜修复机制
阐明ERα抑制抗原释放的分子机制。
通过IP-MS鉴定ERα相互作用蛋白，免疫荧光和Co-IP验证ERα与Galectin-3相互作用，敲低Lgals3检测抗原呈递，LLOMe诱导膜损伤后检测Galectin-3与CHMP4b相互作用，pull-down验证ERα与Galectin-3及CHMP4b直接结合。
验证ERα降解对人MoDC介导CD8+ T细胞激活的影响
评估靶向ERα能否增强人DC介导的抗原特异性CD8+ T细胞激活。
人MoDC经Elacestrant处理降解ERα，PP65蛋白脉冲后与PP65特异性扩增T细胞共培养，流式检测CD8+和CD4+ T细胞IFN-γ表达；并以PP65肽池脉冲作为对照。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证抗原转运与膜修复机制
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR文库感染 | GeCKO v2混合文库 | Addgene | 1000000052 |
| HitransG A转染试剂 | Genechem | REVG004 | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Sangon | E607054 |
| 抗原处理 | 卵清蛋白 | Sangon | A003059 |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778150 |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000075 |
| 流式细胞术 | Zombie Violet可固定活性染料试剂盒 | -- | -- |
| 固定与透化缓冲液套装 | Invitrogen | 88-8824-00 | |
| CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒 | Thermo | C34554 | |
| TruStain FcX PLUS（抗小鼠CD16/32） | -- | -- | |
| 基因组DNA提取 | Quick-DNA小量制备试剂盒 | ZYMO RESEARCH | D3024 |
| sgRNA扩增 | Q5高保真2×预混液 | NEB | M0492 |
| DNA纯化 | DNA清洁与浓缩试剂盒-5 | ZYMO RESEARCH | D4014 |
| Flt3L-DC培养 | IMDM培养基 | Thermo Fisher | 12440053 |
| Flt3L细胞因子 | R&D Systems | 427-FL-25UG | |
| GM-CSF细胞因子 | Thermo Fisher | 315-03-5UG | |
| HEPES缓冲液 | Thermo Fisher | 15630130 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | 25030081 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher | 31350010 | |
| CD8+ T细胞分离 | MojoSort小鼠CD8 T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480035 |
| 脾脏消化 | DNA酶I | Roche | 4716728001 |
| I型胶原酶 | Sigma | V900891-100MG | |
| IV型胶原酶 | Sigma | V900893-100MG | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Biolegend | 420301 |
| 磁珠分选 | CD11c+细胞磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-125-835 |
| B3Z实验 | β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | Beyotime | RG0036 |
| ELISA | 小鼠IFN-γ预包被ELISA试剂盒 | Dakewe | 1210002 |
| 多肽处理 | OVA257-264肽 | Sangon | T510212 |
| PBMC分离 | Histopaque-1077淋巴细胞分离液 | Sigma | 10771 |
| MoDC诱导 | 人GM-CSF | Amoytop | SJA01 |
| 人IL-4 | Novoprotein | GMP-CD03 | |
| T细胞扩增 | PP65蛋白 | Abcam | 43041 |
| 白细胞介素-2 | SL Pharm | 125Ala IL-2 | |
| ERα降解 | 艾拉司群 | MCE | HY-19822 |
| 流式细胞术 | 布雷菲德菌素A | Thermo Fisher | 00-4506-51 |
| 免疫细胞分离 | Percoll分离液 | Sigma | P4937 |
| BMDC诱导 | 白细胞介素-4 | Thermo Fisher | 214-14-20UG |
| ERα降解 | PROTAC ERα降解剂-6 | MCE | HY-157765 |
| DC成熟 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0131 |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 |
| SDS-PAGE凝胶 | Thermo Fisher | NP0336BOX | |
| 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 10600001 | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher | 32209 | |
| Co-IP | 蛋白G磁珠 | CST | 70024 |
| Pull-down | 蛋白G磁珠 | CST | 9006S |
| Galectin-3-His重组蛋白 | MCE | HY-P77684 | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Thermo Fisher | 15596018CN |
| 去激素培养 | 葡聚糖包被活性炭 | Sigma | C6241-5G |
| 无酚红IMDM培养基 | Gibco | 21056023 | |
| 无酚红胰酶 | Gibco | 15090046 | |
| 细胞色素c凋亡实验 | 细胞色素c | Merck | C7752 |
| β-lactamase实验 | CCF4-AM荧光底物 | Invitrogen | K1095 |
| 丙磺舒 | MCE | HY-B0545 | |
| β-内酰胺酶 | Sigma | P0389 | |
| 膜损伤诱导 | L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组CRISPR筛选 | 文库MOI=0.3；嘌呤霉素0.3 μg/ml筛选6天；OVA 3 mg/ml处理48 h；分选前1% pMHC-I高表达细胞；二次筛选前35个基因 阅读提示：Methods“Genome-wide CRISPR/Cas9 screening”及Fig. 1a、1c、1d |
| DC抗原呈递与T细胞共培养 | OVA浓度3 mg/ml或100 μg/ml；OVA257-264肽100 pg/ml；B3Z共培养12 h；OT-1 T细胞共培养16-48 h；B16-F10:cDC1:pMEL比例1:20:100 阅读提示：Methods“OVA-specific T cell response”“pMEL T cell proliferation and activation assay”及Fig. 2、Fig. 4a |
| ERα缺陷或降解DC疫苗体内实验 | 肿瘤细胞接种数量MC38 2×10^6、MC38-OVA 2×10^6、B16-OVA 5×10^5；DC注射剂量5×10^5或2×10^6；注射时间第6、16天或第7、14、21天；ERD-6 1 μM处理24 h；LPS 10 ng/ml 阅读提示：Methods“Analysis of antitumor effect of ERα-deficient DC cells in vivo”“Targeting ERα-based DC vaccine adoptive transfer”及Fig. 3 |
| 吞噬体到胞质抗原转位检测 | 细胞色素c 10 mg/ml处理48 h；β-lactamase 1 KU/ml；CCF4-AM负载1 h；probenecid 1 mM；去激素培养48 h 阅读提示：Methods“Cell apoptosis induced by cytochrome c”“β-lactamase assay”“Hormonal deprivation from the DC culture system”及Fig. 4 |
| 人MoDC与PP65特异性T细胞实验 | Elacestrant 100 nM处理48 h；PP65蛋白10 μg/ml脉冲12 h；PP65肽池250 nM/肽；共培养1 h后BFA处理5 h；健康供者样本量n=12（Fig. 6c） 阅读提示：Methods“CMV PP65-specific human CD8+ T cell response”及Fig. 6c |