鉴定STX17 K254为饥饿诱导的乙酰化位点
确定STX17在自噬过程中是否存在新的乙酰化位点及其修饰水平变化。
利用Flag-HaloTag-STX17敲入HeLa细胞和抗乙酰化赖氨酸抗体富集检测STX17乙酰化；对饥饿处理的Flag-STX17进行LC-MS/MS鉴定乙酰化位点；构建K254R和3KR突变体验证K254乙酰化。
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STX17的乙酰化促进其向自噬体的转位
Acetylation of STX17 promotes its autophagosomal translocation.
实验完整度
高包含细胞系、基因敲除/敲入细胞、体外重构、单分子追踪、LC-MS/MS及结构预测等多层证据并完成功能与机制验证
主要模型
HeLa细胞（STX17敲除及Flag-HaloTag-STX17敲入） HEK293T细胞（STX17及其突变体稳定表达） MEF细胞（GFP-LC3B/mScarlet-STX17稳定表达）
重点核对
EBSS诱导自噬处理时间（除非另作说明为2 h） STX17 K254R/3KR突变体与K254Q突变体的构建与使用 STX17敲除HeLa细胞中回补Flag-STX17 WT或K254R的比较 SIRT1抑制剂EX-527（25 μM，16 h）与GCN5抑制剂MB-3（50 μM，16 h）处理 LC-MS/MS鉴定K254乙酰化位点及STX17 WT与K254R互作蛋白差异
摘要
自噬是维持细胞稳态的基本过程，STX17介导的自噬体-溶酶体融合对货物降解和循环至关重要。STX17向自噬体膜的转位是融合所必需的，但调控这一过程的机制仍不完全清楚。在此，我们发现饥饿后STX17在赖氨酸254（K254）位点被乙酰化，这促进STX17向自噬体转位及随后的自噬体-溶酶体融合。乙酰转移酶GCN5介导STX17 K254乙酰化，而去乙酰化酶SIRT1则拮抗这一修饰。此外，K254乙酰化STX17的自噬体转位由肌球蛋白VI介导。因此，我们的研究强调了乙酰化和基于F-肌动蛋白的马达蛋白在STX17自噬体转位及自噬体-溶酶体融合中的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 饥饿条件下STX17如何从胞质池转位至自噬体膜并促进自噬体-溶酶体融合，其翻译后修饰机制是什么。
- 核心机制
- 饥饿诱导STX17 K254乙酰化，GCN5催化该乙酰化而SIRT1介导去乙酰化；K254乙酰化增强STX17与肌球蛋白VI（MYO6）的结合，促进STX17向自噬体转位，进而促进自噬体-溶酶体融合。
- 主要证据
- 在Flag-HaloTag-STX17敲入HeLa细胞和STX17敲除回补细胞中，K254R突变降低STX17与SNAP29/VAMP8结合、减少自噬体定位并抑制自噬体-溶酶体融合；体外自噬体STX17招募实验、单分子追踪、LC-MS/MS互作组分析和AlphaFold 3结构预测支持K254乙酰化增强STX17-MYO6互作。
- 研究意义
- 研究强调乙酰化和基于F-肌动蛋白的马达蛋白在STX17自噬体转位及自噬体-溶酶体融合中的重要性，并提出以K254乙酰化为中心的GCN5-SIRT1-STX17-MYO6轴可能作为干预自噬体-溶酶体融合受损相关疾病的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证K254乙酰化对自噬体-溶酶体融合和自噬降解的功能重要性
明确K254乙酰化是否影响STX17在晚期自噬中的功能。
在STX17敲除HeLa细胞中回补Flag-STX17 WT或K254R，检测p62和LC3B-II降解、RFP-GFP-LC3B的GFP/RFP比值、CQ处理下LC3B puncta数量和自噬体数量及开放/闭合比。
检测K254乙酰化对STX17自噬体定位和转位的影响
确定K254乙酰化是否调控STX17从胞质向自噬体的转位。
检测STX17 K254R与SNAP29、VAMP8、SNAP47的结合及与LC3B/Lamp1共定位；免疫荧光观察STX17 puncta与LC3B共定位；单分子追踪HaloTag-STX17 WT或K254R在mScarlet-LC3B上的驻留；建立体外自噬体STX17招募实验。
鉴定GCN5为STX17 K254乙酰转移酶
确定催化STX17 K254乙酰化的乙酰转移酶。
免疫共沉淀筛选与STX17结合的乙酰转移酶；检测GCN5过表达/敲低及催化失活突变体4A对STX17乙酰化的影响；GST pulldown验证直接结合；体外乙酰化实验；检测GCN5对STX17自噬体定位和自噬体-溶酶体融合的影响。
鉴定SIRT1为STX17 K254去乙酰化酶
确定介导STX17 K254去乙酰化的去乙酰化酶。
用NAM和TSA处理区分HDAC与SIRT家族；筛选与STX17互作的SIRT；检测SIRT1过表达/敲低及催化失活突变体H363Y对STX17乙酰化的影响；GST pulldown验证直接结合；检测EX-527对STX17自噬体定位的影响。
鉴定MYO6介导STX17向自噬体转位
确定介导STX17转位的马达蛋白及其与K254乙酰化的关系。
LC-MS/MS比较STX17 WT与K254R互作蛋白并经GO分析聚焦F-肌动蛋白相关蛋白；验证STX17与MYO6互作；构建MYO6敲除细胞并回补MYO6 WT或KRDY突变体；使用MYO6抑制剂TIP和肌动蛋白聚合抑制剂cytochalasin B；检测K254乙酰化对STX17-MYO6结合的影响。
结构预测分析K254乙酰化增强STX17-MYO6结合的分子基础
从结构层面解释K254乙酰化如何增强STX17与MYO6的互作。
使用AlphaFold 3预测STX17 WT、K254R、K254Q与MYO6复合物结构，分析非共价键数量、界面面积和结合自由能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
结构预测与数据分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Cellmax | CGM101.06 |
| 胎牛血清 | Cellmax | SA201.02 | |
| 自噬诱导 | Earle平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | E7510 |
| 葡萄糖饥饿 | 无葡萄糖DMEM | Gibco | A1443001 |
| SIRT1抑制 | EX-527 | Selleckchem | S1541 |
| GCN5抑制 | MB-3 | Sigma-Aldrich | M2499 |
| HDAC抑制 | 曲古抑菌素A | Selleckchem | S1045 |
| SIRT抑制 | 烟酰胺 | Selleckchem | S1899 |
| 肌球蛋白II抑制 | blebbistatin | Selleckchem | S7099 |
| MLCK抑制 | ML-7盐酸盐 | Selleckchem | S8388 |
| 抑制肌动蛋白聚合 | 细胞松弛素B | Sigma-Aldrich | C6762 |
| 抑制自噬体-溶酶体融合 | 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 |
| 巴弗洛霉素A1 | Selleckchem | S1413 | |
| Western blot | 抗LC3B抗体（兔） | Cell Signaling Technology | 3868 |
| 抗p62抗体（兔） | MBL International | PM045 | |
| 抗Flag抗体（鼠） | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体（兔） | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗SIRT1抗体（兔） | Abcam | ab32441 | |
| 抗GCN5抗体（兔） | Cell Signaling Technology | 3305 | |
| 抗STX17抗体（兔） | Proteintech | 17815-1-AP | |
| 抗MYO6抗体（兔） | Proteintech | 26778-1-AP | |
| 抗V5抗体（兔） | Huabio | ET1605-41 | |
| 抗STING抗体（兔） | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体（鼠） | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| HRP标记山羊抗鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647标记山羊抗鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A-21236 |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | A-11036 | |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100 | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Amresco | 97062-904 | |
| 免疫沉淀 | Protein A Sepharose珠 | GE Healthcare | 17078001 |
| 抗GFP纳米抗体琼脂糖珠 | AlpaLifeBio | KTSM1301 | |
| 抗Flag纳米抗体磁性琼脂糖珠 | AlpaLifeBio | KTSM1361 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Selleckchem | B14002 | |
| GST pulldown | 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Healthcare | 17075601 |
| 蛋白纯化 | ProBond树脂 | Life Technologies | R80101 |
| 3×Flag肽 | Beyotime | P9801 | |
| 蛋白染色 | 考马斯亮蓝 | Meilunbio | MA0399 |
| 体外乙酰化实验 | 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2056 |
| ATP | NEB | P0756S | |
| 体外自噬体STX17招募实验 | 磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich | P7936 |
| 肌酸磷酸激酶 | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| ATP | Cytoskeleton | BSA04 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Torin 1 | Selleckchem | S2827 | |
| LYN-1604 | Selleckchem | S8597 | |
| 密度梯度离心 | OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 |
| 单分子追踪 | HaloTag配体Janelia Fluor 646 | Promega | GA1121 |
| 敲入细胞筛选 | HaloTag配体Janelia Fluor 549 | Promega | GA1111 |
| 慢病毒感染 | Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 潮霉素B | Gibco | 10687010 | |
| 质粒构建 | 同源重组试剂盒 | ABclonal | RK21020 |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-1 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 免疫金电子显微镜 | 抗mCherry一抗 | Abcam | ab167453 |
| 6 nm金标记山羊抗兔IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-195-144 | |
| 抗GFP一抗 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| 12 nm金标记山羊抗鼠IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-205-146 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 自噬诱导与抑制剂处理 | EBSS处理时间（默认2 h）、EX-527 25 μM 16 h、MB-3 50 μM 16 h、TIP 25 μM 2 h、CQ 50 μM 2 h、Baf A1 50 nM 3 h等浓度与时间 阅读提示：Methods的Cell culture小节 |
| STX17突变体构建与回补 | K254R、K254Q、2KR、3KR、GCN5 4A、SIRT1 H363Y、MYO6 KRDY等突变位点及使用的细胞系 阅读提示：Methods的Plasmid construction、Generation of knockout and stable cell lines小节 |
| 体外自噬体STX17招募实验 | 胞质与膜组分来源、蛋白浓度（胞质2 mg/mL）、反应温度30 °C、反应时间1.5 h、ATP再生系统、GTP 0.15 mM、Torin 1 200 nM、LYN-1604 2 μM 阅读提示：Methods的Cytosolic and membrane fractions preparation, in vitro autophagosomal STX17 recruitment assay小节 |
| 单分子追踪 | HaloTag配体浓度100 pM、标记时间30 min、成像帧率50 Hz、曝光时间100 ms、时间间隔5 s 阅读提示：Methods的Live cell single-molecule tracking assay小节 |
| LC-MS/MS | 样本处理（EBSS 2 h或1 h）、生物学重复数（3次）、质谱参数与数据库 阅读提示：Methods的Sample preparation for LC-MS/MS assay、In-gel digestion and LC-MS/MS analysis小节 |