RBP序列与结构保守性分析
评估RBP及其核心RBD在11个物种间的序列和结构保守模式
从UniProt收集216个RBP在11个物种的蛋白序列和结构，用ClustalX计算序列相似性，用US-align计算结构相似性（TM-score和pLDDT），从InterPro获取130个RBD注释并提取局部结构进行比较
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利用RNA结合蛋白的进化保守性增强多物种蛋白质-RNA相互作用的预测
Augmented prediction of multi-species protein-RNA interactions using evolutionary conservation of RNA-binding proteins.
实验完整度
高基于11物种的CLIP-seq数据训练深度学习模型，并进行体外RNA pull-down、体内POND-qPCR实验验证
主要模型
11个物种（人、猩猩、猴、小鼠、大鼠、鸡、蛙、斑马鱼、果蝇、拟南芥、酵母） HEK293T细胞系 小鼠和斑马鱼同源RBP
重点核对
跨物种模型训练使用44个数据集（来自17个RBP，涵盖人、小鼠、斑马鱼、果蝇） 输入序列长度设为200nt，标签平滑和梯度权重自适应结合 RNA pull-down实验使用200 pmol生物素化RNA寡核苷酸与HEK293T细胞裂解液孵育 POND-qPCR实验使用150,000个HEK293T细胞共转染200 ng EPN24-PUM2质粒和75 ng GFP-REF/ALT靶质粒 所有实验使用3次生物学独立重复
摘要
RNA结合蛋白（RBP）在基因表达调控中发挥关键作用。近期研究已开始详细揭示多种RBP的RNA识别机制。然而，鉴于目前已研究的RBP数量，对数百个RBP在多种非模式生物中的结合峰进行实验分析是不切实际的。在此，我们提出MuSIC（利用保守性的多物种RBP-RNA相互作用），一个基于深度学习的框架，通过利用标签平滑和RBP在从人类到酵母的11个系统发育多样物种间的进化保守性来预测跨物种RBP-RNA相互作用。MuSIC优于最先进的计算方法，并在跨物种的RBP结合峰预测中达到高度准确。预测置信度在后生动物物种中更高，部分反映了RBP保守模式的差异。最后，同源遗传变异对RBP结合的影响可以在跨物种中计算量化，随后进行实验验证。结合事件被破坏的靶转录本在泛素化相关通路中富集。总之，MuSIC提供了一个有用的计算框架，用于预测跨物种RBP-RNA相互作用并量化遗传变异对RBP结合的影响，为RBP介导的与人类疾病相关的调控机制提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用RBP的进化保守性计算预测跨物种RBP-RNA相互作用，并量化遗传变异对RBP结合的影响？
- 核心机制
- RBP的核心RNA结合结构域在进化上高度保守，其序列和结构保守性可作为一种标签平滑系数，整合到深度学习框架中以增强跨物种预测的泛化能力。
- 主要证据
- MuSIC在44个跨物种数据集上平均AUC达0.91，优于PaRPI（0.58）、HDRNet（0.72）等方法；体外RNA pull-down和体内POND-qPCR实验验证了预测的同源SNV对PUM2结合的影响。
- 研究意义
- MuSIC为预测跨物种RBP-RNA相互作用和量化遗传变异对RBP结合的影响提供了有用的计算框架，为RBP介导的与人类疾病相关的调控机制提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
跨物种RBP-RNA结合峰数据整理与模型训练
构建并训练MuSIC深度学习模型以预测跨物种RBP-RNA相互作用
从POSTAR3和modENCODE收集RBP结合峰，统一预处理（去除重复和短于5nt的峰，选top 5000，延伸200nt，随机选5000个阴性序列），使用ProtT5和RiNALMo提取蛋白和RNA嵌入，结合RNA二级结构预测，采用标签平滑和梯度权重自适应训练模型
MuSIC跨物种预测性能基准测试
比较MuSIC与现有计算方法在跨物种RBP-RNA相互作用预测中的准确性
在274个数据集（186个RBP）上评估，包括230个同物种数据集和44个跨物种数据集，与PaRPI、HDRNet、PrismNet、DeepBind、GraphProt比较AUC、ACC、AUPRC指标，并评估预测峰与实验峰的overlap
系统预测11物种RBP结合峰和motif
利用MuSIC在11个物种中系统预测184个RBP的结合峰和富集motif
用184个RBP的高质量峰数据集训练2018个模型，对各物种RNA片段（200nt，随机采样20,000个）预测结合峰，用MEME鉴定富集motif（结合概率>0.9的片段），并进行motif聚类分析
同源SNV对RBP结合影响的预测与实验验证
量化同源SNV对RBP结合的影响并进行实验验证
从dbSNP提取人类同义SNV（32,207个）及其小鼠同源区域SNV（85,599个），用MuSIC预测REF和ALT等位基因的结合概率，计算ΔSNV，筛选ΔSNV<-0.5的SNV，选择3个PUM2结合受影响的SNV进行体外RNA pull-down和体内POND-qPCR验证
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | 2× Phanta Max Master Mix | Vazyme | -- |
| Hieff Clone® Plus一步克隆试剂盒 | Yeasen | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 2× MultiF无缝组装混合液 | ABclonal | -- | |
| 细胞转染 | JetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| RNA pull-down | 磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- | |
| SUPERase•In RNA酶抑制剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Vazyme | CA-28 | |
| Western blot | HRP标记小鼠单克隆anti-Myc抗体 | Beyotime | AF2867 |
| anti-β-actin抗体 | CST | 4970 | |
| HRP标记二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 增强化学发光（ECL）试剂 | Merck Millipore | WBKLS0050 | |
| eBLOT14 Touch成像仪 | e-BLOT | -- | |
| POND-qPCR | 0.45 µm醋酸纤维素滤膜 | Corning | -- |
| TRIzol试剂 | Magen | -- | |
| ERCC合成spike-in RNA | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HiScript® III逆转录SuperMix | Vazyme | -- | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 跨物种模型训练 | 数据集来源（POSTAR3和modENCODE）、RBP数量（17个）、数据集数量（44个）、训练-验证分割比例（4:1）、输入序列长度（200nt） 阅读提示：Methods 'Compiling RBP-binding peak datasets'和'MuSIC hyperparameter settings' |
| RNA pull-down实验 | 生物素化RNA量（200 pmol）、HEK293T细胞数（~1×10⁷）、裂解液组成、孵育时间（4°C 3–4 h）、链霉亲和素磁珠用量（100 µl）、洗涤条件 阅读提示：Methods 'RNA pull-down assay' |
| POND-qPCR实验 | HEK293T细胞数（150,000/孔）、EPN24-PUM2质粒量（200 ng）、GFP-REF/ALT靶质粒量（75 ng）、转染试剂（JetPRIME）、上清收集时间（更换培养基后24 h） 阅读提示：Methods 'Cell transfection'和'POND-qPCR' |
| 同源SNV分析 | 人类同义SNV数量（32,207）、小鼠同源SNV数量（85,599）、ΔSNV阈值（<−0.5）、用于实验验证的SNV数量（3个） 阅读提示：Methods 'Quantifying the effects of homologous SNVs between human and mouse on RBP-binding using MuSIC' |
| motif鉴定与聚类 | RBP数量（184）、模型数量（2018）、每物种采样片段数（20,000）、motif鉴定结合概率阈值（>0.9）、聚类方法（层次聚类） 阅读提示：Methods 'Identifying and clustering RBP-binding motifs' |