构建TMEM65报告小鼠及条件敲除小鼠
在体内研究TMEM65的组织表达及功能缺失影响。
构建TMEM65-V5敲入报告小鼠，以及基于Tmem65fl/fl与CMV-Cre、Nestin-Cre、Myf6-Cre杂交的全身、神经、肌肉特异性敲除小鼠。
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小鼠中TMEM65的缺失导致由线粒体Ca2+介导的线粒体疾病
Loss of TMEM65 in mice causes mitochondrial disease mediated by mitochondrial Ca2.
实验完整度
高构建全身、神经、肌肉特异性敲除及报告小鼠，结合存活、代谢、蛋白组和线粒体钙功能验证，并有MCU敲除挽救实验。
主要模型
全身性Tmem65敲除小鼠（Tmem65−/−） 神经系统特异性Tmem65敲除小鼠（Tmem65fl/fl::NesCre） 骨骼肌特异性Tmem65敲除小鼠（Tmem65fl/fl::Myf6Cre） Tmem65−/−::Mcu−/−双敲除小鼠
重点核对
Tmem65−/−小鼠平均寿命21.7±3.6天，介于P11-P30死亡 Tmem65fl/fl::NesCre小鼠平均寿命20.5±2.3天，介于P18-P29死亡 2月龄Tmem65fl/fl::Myf6Cre小鼠FDB肌纤维线粒体Ca2+水平升高 Tmem65fl/fl::Myf6Cre小鼠线粒体Na+依赖Ca2+外排丧失，脑线粒体同样减少 Tmem65−/−::Mcu−/−小鼠寿命延长至>1年，运动能力恢复
摘要
跨膜蛋白65（TMEM65）在患者中的缺失导致严重的线粒体脑肌病，凸显了其临床重要性。近期研究表明，TMEM65在体外作为线粒体Na+/Ca2+交换器发挥作用。在此，我们构建了条件性Tmem65敲除小鼠，以在体内确定其在神经肌肉组织中的作用。全身性和神经系统特异性Tmem65敲除小鼠均表现出严重的生长迟缓和约3周龄时的癫痫相关猝死，确立TMEM65对神经元功能不可或缺。此外，骨骼肌特异性敲除导致成年发病的肌病，并先于其出现线粒体Ca2+升高。一致地，TMEM65的缺失导致Na+依赖的线粒体Ca2+外排丧失。值得注意的是，通过线粒体钙单向转运体（MCU）敲除阻断线粒体Ca2+进入，可挽救全身性Tmem65缺失的早期致死性，将寿命从约3周延长至>1年。这些数据揭示了TMEM65重要的生理作用，并提示调节线粒体Ca2+可能为TMEM65表达异常及其他与Ca2+超载相关的线粒体疾病提供治疗价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TMEM65在哺乳动物神经肌肉组织中的生理功能及其与线粒体Ca2+调控的关系是什么？
- 核心机制
- TMEM65介导线粒体Na+依赖的Ca2+外排，其缺失导致线粒体Ca2+超载，进而引起神经元功能障碍和肌肉病变；阻断MCU介导的Ca2+内流可重新平衡线粒体Ca2+并挽救表型。
- 主要证据
- 全身、神经和肌肉特异性Tmem65敲除小鼠均表现相应表型；肌肉特异性敲除小鼠线粒体Ca2+升高且Na+依赖Ca2+外排丧失；MCU敲除将Tmem65−/−小鼠寿命从约3周延长至>1年并恢复运动能力。
- 研究意义
- 揭示TMEM65在体内的必需生理作用，并提示调节线粒体Ca2+可能为TMEM65表达异常及其他与Ca2+超载相关的线粒体疾病提供治疗价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TMEM65表达与定位
确认TMEM65蛋白在组织中的表达及亚细胞定位。
Western blot检测TMEM65-V5小鼠组织蛋白表达，免疫荧光分析脑和心脏组织及分离肌纤维中的线粒体共定位。
评估全身和神经特异性敲除小鼠表型
确定TMEM65缺失的整体生理后果及神经元作用。
监测体重、存活、抓力、癫痫行为，并进行脑MRI和H&E染色。
评估骨骼肌特异性敲除小鼠表型
确定TMEM65在骨骼肌维持中的作用。
监测体重、肌肉质量、肌纤维横截面积、肌球蛋白亚型、代谢笼参数和自主跑轮活动。
蛋白质组学分析肌肉TMEM65缺失
揭示肌肉特异性敲除后的分子变化。
对2月龄和10月龄比目鱼肌进行TMT质谱蛋白质组学分析，并进行GO富集分析和Western blot验证。
检测线粒体钙处理功能
验证TMEM65缺失对线粒体Ca2+摄取、保留和外排的影响。
使用Rhod-2和MitoTracker Green测量FDB肌纤维线粒体Ca2+，在分离线粒体中进行Ca2+摄取和外排实验，并检测膜电位和氧化磷酸化功能。
MCU敲除挽救实验
检验阻断线粒体Ca2+内流能否挽救TMEM65缺失表型。
将Tmem65−/−与Mcu−/−杂交，评估存活、体重、抓力、代谢、跑轮能力和肌纤维类型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | 啮齿动物饲料 | LabDiet | 5021 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | 20–188 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| NuPAGE 10% Bis-Tris蛋白凝胶 | Life Technologies | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| XCell II转印模块 | Invitrogen | -- | |
| 封闭液 | Li-Cor | P/N927-40000 | |
| IRDye二抗 | Li-Cor | -- | |
| Azure c600成像系统 | Azure Biosystems | -- | |
| Chameleon duo预染蛋白梯 | Li-Cor | 928-60000 | |
| 抗TMEM65抗体 | Sigma-Aldrich | HPA025020 | |
| 抗TMEM65抗体 | Invitrogen | PA5-112762 | |
| 抗V5抗体 | Life Technologies | R960-25 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Li-Cor | P/N 926-42212 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 抗MCU抗体 | Sigma-Aldrich | HPA016480 | |
| 抗LETM1抗体 | Proteintech | 16024-1-AP | |
| 抗NCLX抗体 | Proteintech | 21430-1-AP | |
| 抗GHITM抗体 | Proteintech | 16296-1-AP | |
| 抗复合物IV亚基IV抗体 | Invitrogen | A21348 | |
| Oxphos啮齿动物Western blot抗体混合物 | Invitrogen | 45-8099 | |
| 抗热休克蛋白60抗体 | Invitrogen | PA5-79414 | |
| 抗VDAC抗体 | Cell Signaling Technology | 4611 | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads免疫共沉淀试剂盒 | Life Technology | 14321D |
| 免疫荧光 | ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Life Technologies | -- |
| 抗ATP5A抗体 | Abcam | ab14748 | |
| 抗V5抗体 | Cell Signal Technology | 13202S | |
| 抗TMEM65抗体 | Sigma-Aldrich | HPA025020 | |
| 抗Desmin抗体 | Sigma-Aldrich | D1033 | |
| 抗Connexin 43抗体 | Abcam | ab11370 | |
| 抗I型肌球蛋白重链抗体 | DSHB | BA-D5 | |
| 抗IIa型肌球蛋白重链抗体 | DSHB | SC-71 | |
| 抗IIb型肌球蛋白重链抗体 | DSHB | BF-F3 | |
| 抗Laminin抗体 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 线粒体钙成像 | Rhod-2-AM | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MitoTracker Green | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 线粒体分离 | 枯草杆菌蛋白酶A | Sigma-Aldrich | P3910 |
| 线粒体钙摄取/外排 | Calcium Green-5N | -- | -- |
| CLARIOstar Plus酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 线粒体钙外排 | Ru360 | -- | -- |
| 线粒体膜电位 | 四甲基罗丹明甲酯 | -- | -- |
| MitoTracker Green | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 氧消耗测量 | Oxygraph+系统 | Hansatech Instruments | -- |
| 质谱 | TMT 16plex标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MRI | 马根维显 | Bayer HealthCare Pharmaceuticals | -- |
| 14 T Bruker显微成像系统 | Bruker | -- | |
| 超声心动图 | Vevo2100超声系统 | VisualSonics | -- |
| 30 MHz超声探头 | VisualSonics | MS-400 | |
| 代谢笼 | Oxymax-CLAMS系统 | Columbus Instruments | -- |
| 体成分分析 | EchoMRI体成分分析仪 | -- | -- |
| 自主跑轮 | 低剖面无线跑轮 | Med Associates Inc. | -- |
| 家庭笼监测 | PhenoTyper家庭笼 | Noldus | -- |
| 基因分型 | Cas9 mRNA | TriLink | L-7606 |
| 质粒 | C端Flag标签人NCLX质粒 | OriGene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 存活分析 | 小鼠品系背景、基因型、样本量（Tmem65−/− n=45，对照n=31；Tmem65fl/fl::NesCre n=32，对照n=17；Tmem65−/−::Mcu−/− n=10等）及观察终点 阅读提示：Methods中Animal studies及Generation of transgenic mice小节；Fig. 1g、Fig. 2f、Fig. 6b图注 |
| 线粒体钙外排实验 | 线粒体蛋白量100 μg、Ca2+负荷50 μM、Ru360 3 μM、NaCl 20 mM、Calcium Green-5N 1 μM、呼吸缓冲液组成 阅读提示：Methods中Measurement of Ca2+ uptake/retention capacity and Ca2+ efflux from isolated mitochondria小节；Fig. 5e/f图注 |
| 肌肉特异性敲除表型分析 | 小鼠年龄（2、6、10月龄等）、性别、样本量、检测指标（体重、肌纤维横截面积、肌球蛋白亚型、代谢笼参数） 阅读提示：Methods中Indirect calorimetry、Running wheel、Mass spectrometry小节；Fig. 3、Fig. 4图注 |
| MCU敲除挽救实验 | Tmem65−/−::Mcu+/+、Tmem65−/−::Mcu+/−、Tmem65−/−::Mcu−/−的基因型、样本量、检测时间点（存活、抓力P20-21、代谢3.5月龄、跑轮4.5月龄、肌纤维6月龄） 阅读提示：Methods中Inverted grip suspension test、Indirect calorimetry、Running wheel小节；Fig. 6图注 |
| 蛋白质组学分析 | 小鼠年龄（2月龄和10月龄）、样本量（2月龄对照和KO各n=4，10月龄对照n=3、KO n=4）、TMT标记、质谱平台和差异分析阈值 阅读提示：Methods中Mass spectrometry和Gene ontology analyses小节；Fig. 4图注 |