建立NSs标记细胞系并验证双标记病毒
实现对单个核内HIV-1核心脱壳过程与NSs定位的同时可视化。
构建稳定表达HALO-SRSF1的HeLa细胞系，用HALO-JF549标记NSs；制备GFP-CA和cmHALO（JF646）双标记HIV-1颗粒，并通过单病毒分析及western blot验证标记。
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HIV-1脱壳位置决定整合位点
HIV-1 uncoating location dictates sites of integration.
实验完整度
高体外细胞系活细胞成像追踪病毒核心、CPSF6敲除细胞、前病毒定位成像及整合位点测序分析
主要模型
HeLa:HALO-SRSF1细胞系 HeLa:CKO+SNAP-CPSF6+HALO-SRSF1细胞系 HeLa:Bgl-mCherry细胞系 293T细胞包装的VSV-G假型HIV-1病毒颗粒
重点核对
PF74使用终浓度10 µM，LEN使用终浓度100 nM（部分整合位点实验为10 nM），在病毒核心进入核并定位于NSs后加入 活细胞成像时间窗：未处理细胞在感染后10–12小时成像；PF74组每40秒采集共10分钟；LEN组每5分钟采集共30分钟 脱壳判定：cmHALO或HALO-CA信号丢失表示核心完整性丧失，GFP-CA信号丢失表示衣壳晶格解体 整合位点分析：PF74或LEN在感染后10小时加入，感染后约22小时固定检测转录位点，或培养4天后提取gDNA测序 细胞系CPSF6敲除验证：western blot检测CPSF6表达，7个单克隆合并为HeLa:CKO
摘要
HIV-1核心进入细胞核并在其整合位点附近发生衣壳解体（脱壳）。尽管大多数病毒核心定位于核斑点（NSs），但脱壳位点与整合位点之间的空间关系仍不清楚。在此，我们利用荧光标记的HIV-1核心和NS标志物，显示脱壳主要发生在NSs内。在核进入后用衣壳抑制剂PF-3450074（PF74）或lenacapavir（LEN）处理感染细胞，诱导衣壳与切割和多聚腺苷酸化特异性因子6（CPSF6）之间的相互作用迅速破坏，随后HIV-1核心从NSs退出，表明CPSF6结合是使病毒核心滞留于NSs所必需的。与未处理细胞中在NSs内脱壳的病毒核心相比，PF74或LEN处理导致核心破坏并出现转录活跃的前病毒，且其位置距NSs更远。这种空间位移与整合进入基因丰富、转录活跃的斑点相关染色质结构域（HIV-1整合的首选位点）减少以及整合进入远离核膜的基因稀疏的核纤层相关结构域增加相关。这些发现表明，HIV-1脱壳位点是整合靶向的关键决定因素，且衣壳抑制剂可通过将脱壳重新定位到NSs外而使整合发生错误定向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HIV-1脱壳位点与核斑点（NSs）及整合位点之间的空间关系如何，脱壳位置是否决定整合靶向。
- 核心机制
- CPSF6结合使病毒核心滞留于NSs内；在NSs内脱壳后释放的vDNA以PIC形式离开NSs并短距离移动至邻近SPADs整合。PF74或LEN在核进入后置换衣壳上的CPSF6，导致核心退出NSs并在NSs外脱壳，使整合从SPADs转向基因稀疏的LADs等染色质区域。
- 主要证据
- 双标记HIV-1核心活细胞成像显示31个脱壳核心均在NSs内失去cmHALO、84%在NSs内失去GFP-CA；PF74/LEN处理后核心退出NSs并在NSs外脱壳；IN-sfGFP追踪显示脱壳后IN-sfGFP复合物退出NSs；前病毒成像显示抑制剂诱导脱壳的前病毒距NSs更远（约1.0 µm vs WT约0.6 µm）；整合位点测序显示SPADs整合减少、LADs整合增加。
- 研究意义
- 证明HIV-1脱壳位点是整合位点选择的关键决定因素，并揭示衣壳抑制剂可通过将脱壳位置改变至NSs外而使整合错误定向，对理解病毒基因表达调控及潜伏病毒库的建立和再激活具有潜在意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
活细胞成像追踪核内核心脱壳与NSs定位
确定未处理细胞中脱壳发生的位置及其与NSs的关系。
感染双标记HIV-1后于感染后10–12小时进行三维单病毒追踪，分析cmHALO和GFP-CA信号丢失的时间顺序及相对NSs的位置。
衣壳抑制剂处理后的脱壳定位分析
评估PF74或LEN在核进入后处理对核心完整性、NSs定位和脱壳位置的影响。
在病毒核心进入核并定位于NSs后加入PF74或LEN，活细胞成像追踪cmHALO、GFP-CA和NSs信号，统计核心破裂和退出NSs的时间与顺序。
CPSF6置换与核心退出NSs的关系验证
验证CPSF6结合是否为使核心滞留于NSs所必需。
在HeLa:CKO+SNAP-CPSF6+HALO-SRSF1细胞中感染GFP-CA标记病毒，PF74或LEN处理后追踪SNAP-CPSF6信号与核心退出NSs的关系。
IN-sfGFP追踪vDNA释放与NSs退出
确定脱壳后vDNA（PIC）何时离开NSs及与残余衣壳的关系。
用HALO-CA和IN-sfGFP双标记病毒，识别感染后10–12小时发生脱壳的核心，追踪IN-sfGFP信号最长1小时，并检测PF74/LEN处理后的NSs退出。
前病毒空间定位成像
比较不同脱壳来源的前病毒与NSs及核膜的空间距离。
用含18拷贝Bgl茎环的HIV-3.9 kb（抑制剂诱导脱壳）或HIV-10.7 kb（WT CA或N74D CA，未处理）感染HeLa:Bgl-mCherry细胞，固定后免疫染色SRRM2标记NSs，测量前病毒与NSs及核边界距离。
整合位点测序分析
确定脱壳位置改变对整合位点基因组分布的影响。
用HIV-8.4 kb或HIV-3.1 kb感染HeLa细胞，在指定时间加入PF74或LEN，提取gDNA进行整合位点测序，映射至hg19并分析基因、基因密度、SPADs和LADs分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | PF74 | Sigma | -- |
| lenacapavir | MedChemExpress | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| TrypLE细胞解离液 | Gibco | -- | |
| 病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| 病毒标记 | JF646染料 | -- | -- |
| 活细胞成像 | Halo-JF549染料 | -- | -- |
| SNAP-Cell 647-SiR染料 | -- | -- | |
| 核输入定量 | BioTracker 650红色核染料 | Millipore | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗SRRM2抗体 | Invitrogen | PA5-66827 |
| Alexa Fluor 488标记驴抗兔抗体 | Invitrogen | A21206 | |
| 小鼠抗SC-35抗体 | Sigma-Aldrich | S4045 | |
| Cy5标记山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A10524 | |
| Western blot | 兔抗CPSF6抗体 | Sigma-Aldrich | HPA039973 |
| 小鼠抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 小鼠抗p24抗体 | NIH HIV Reagent Program | ARP-6458 | |
| 兔抗GFP抗体 | ThermoFisher Scientific | A6455 | |
| 兔抗HALO抗体 | Promega | G9281 | |
| IRDye 800CW标记山羊抗兔二抗 | LI-COR | 926-32211 | |
| IRDye 680标记山羊抗小鼠二抗 | LI-COR | 926-68070 | |
| IRDye-800CW山羊抗兔 | LI-COR | -- | |
| IRDye-680RD山羊抗小鼠 | LI-COR | -- | |
| 病毒裂解 | Pierce RIPA裂解液 | ThermoFisher | -- |
| gDNA提取 | QIAamp DNA血液大提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 测序文库构建 | NEBNext Ultra II FS | NEB | -- |
| 分子克隆 | NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | New England Biolabs | -- |
| 细胞培养耗材 | 玻璃底μ-slide | Ibidi | -- |
| 感染检测 | Britelite plus报告基因检测系统 | Revvity | -- |
| SpectraMax iD3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 活细胞成像 | Nikon Eclipse Ti-E显微镜配横河CSU-W1转盘单元 | Nikon | -- |
| ORCA-fusion BT相机 | Hamamatsu | -- | |
| Tokai Hit显微镜载物台培养箱 | Tokai Hit | -- | |
| Western blot成像 | Odyssey红外成像系统 | LI-COR | -- |
| 流式分析 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 活细胞成像追踪核内脱壳 | 感染后成像时间窗（10–12小时）、成像间隔（10分钟）、z-stack层数与步长（12层，0.4 µm）、NSs判定阈值（JF549≥背景1.1倍） 阅读提示：Methods中'Live-cell imaging of uncoating of dual-labeled viral cores in HeLa:HALO-SRSF1 cells'小节及Fig. 1c |
| PF74/LEN处理诱导脱壳 | 药物终浓度（PF74 10 µM；LEN 100 nM）、加入时间（感染后3–6小时）、成像间隔（PF74每40秒共10分钟；LEN每5分钟共30分钟） 阅读提示：Methods中'Live-cell imaging of uncoating of dual-labeled viral cores in HeLa:HALO-SRSF1 cells'小节及Fig. 2a、b |
| CPSF6置换与NSs退出 | 细胞系（HeLa:CKO+SNAP-CPSF6+HALO-SRSF1）、染料浓度（SNAP-Cell 647-SiR 100 nM、Halo-JF549 100 nM孵育60分钟）、药物加入时间与浓度 阅读提示：Methods中'Live-cell imaging of GFP-CA-labeled viral cores in HeLa:SNAP-CPSF6 + HALO-SRSF1 cells'小节及Fig. 3c |
| IN-sfGFP追踪vDNA释放 | 病毒标记组合（HALO-CA+IN-sfGFP）、脱壳定义（HALO-CA丢失）、脱壳识别时间窗（10–12小时）、PF74/LEN加入时间 阅读提示：Methods中'Live-cell imaging of uncoating of dual-labeled viral cores in HeLa:HALO-SRSF1 cells'小节及Fig. 4b |
| 前病毒空间定位 | Bgl-mCherry诱导条件（1 µg/ml多西环素）、aphidicolin浓度（10 µg/ml）、药物加入时间（感染后10小时）与浓度（PF74 10 µM；LEN 100 nM）、固定时间（感染后约22小时）、SRRM2染色抗体 阅读提示：Methods中'Imaging NSs and transcriptionally active proviruses and image analysis'小节及Fig. 5a、e |
| 整合位点测序 | HIV-3.1 kb药物加入时间（感染后10小时）与浓度（PF74 10 µM；LEN 10 nM或100 nM）、HIV-8.4 kb PF74加入时间（感染后8小时）、培养时间（4天）、测序平台（Illumina MiSeq）、参考基因组（hg19） 阅读提示：Methods中'Integration site analysis'小节及Fig. 6a |