鉴定RUNX1/2为产热脂肪细胞分化的转录屏障
通过无偏表观遗传分析筛选调控棕色脂肪分化的转录因子
对棕色前脂肪细胞及分化第1天细胞进行ATAC-seq，分析差异开放区域和富集motif；检测RUNX1/2在棕色和米色脂肪分化过程中的表达动态。
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抑制脂肪细胞RUNX1/2通过不同机制增强脂肪组织产热
Inhibition of adipocyte RUNX1/2 enhances adipose tissue thermogenesis through distinct mechanisms.
实验完整度
高包含体外棕色/米色脂肪细胞模型、多种基因修饰小鼠模型、患者数据及表观组学，并进行了功能与机制验证
主要模型
永生化原代Ucp1-2A-GFP棕色前脂肪细胞 小鼠iWAT来源SVF诱导的米色脂肪细胞 脂肪细胞特异性RUNX1/2条件敲除小鼠 产热脂肪细胞特异性RUNX1/2敲除小鼠
重点核对
RUNX1/2过表达或敲除后棕色脂肪细胞UCP1、OXPHOS蛋白及产热基因mRNA变化 RUNX1/2 AKO与UKO小鼠在冷暴露（4°C）下的核心体温和生存率 CL-316,243（1 mg/kg）刺激后小鼠VO2和VCO2的间接测热法测定 RUNX1/2与HDAC1的Co-IP及HDAC1敲除对RUNX1/2过表达效应的挽救 RUNX2 IDR缺失突变体对相分离和产热基因抑制能力的影响
摘要
产热脂肪细胞因其将能量以热量形式耗散的能力，在对抗肥胖和代谢疾病方面具有重要治疗前景。然而，产热脂肪细胞激活所依赖的转录调控机制仍未完全阐明。在此，我们鉴定RUNX1和RUNX2是产热脂肪细胞分化和激活的关键转录屏障。RUNX1/2的表达受热应激动态抑制，并与不良代谢特征正相关。在脂肪细胞中基因敲除RUNX1或RUNX2可增强米色脂肪形成，但在雄性小鼠中对全身代谢产生不同影响。相反，强制表达RUNX1/2会抑制产热基因程序并削弱产热脂肪细胞激活。机制上，RUNX1招募HDAC1对产热基因座位实施表观遗传沉默，而RUNX2通过相分离依赖性抑制决定产热细胞命运。值得注意的是，药理学抑制RUNX1/2可增强脂肪产热并改善能量代谢。我们的发现揭示了RUNX在脂肪产热中未被认识的作用，并突出其作为代谢疾病干预治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RUNX1和RUNX2在产热脂肪细胞分化和激活中的功能角色及其转录调控机制是什么？
- 核心机制
- RUNX1招募HDAC1介导产热基因座位的表观遗传沉默，而RUNX2通过其IDR驱动的相分离形成凝聚体，隔离EP300并招募HDAC2等抑制因子，从而抑制产热基因程序。
- 主要证据
- 体外棕色和米色脂肪细胞过表达/敲除实验显示RUNX1/2抑制UCP1和产热基因表达；脂肪细胞和产热脂肪细胞特异性敲除小鼠表现增强的冷耐受和CL诱导的能量消耗；CUT&Tag和ChIP-qPCR证实RUNX1/2直接结合Ebf2、Pgc1α等产热基因；HDAC1敲除挽救RUNX1而非RUNX2的抑制效应；RUNX2 ΔIDR突变体丧失相分离和抑制产热能力。
- 研究意义
- 揭示了RUNX1/2作为脂肪产热转录屏障的新作用，并提示药理学抑制RUNX1/2可能成为增强脂肪产热、干预肥胖相关代谢疾病的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RUNX1/2表达与热应激及代谢性状的关联
探究RUNX1/2在适应性产热和肥胖中的表达变化及临床相关性
检测不同脂肪库、冷暴露（4°C）、热中性（30°C）、CL316243处理及高脂饮食小鼠中RUNX1/2表达；分析人脂肪组织公共数据库中RUNX1/2表达与代谢指标的相关性。
体外过表达和敲除实验验证RUNX1/2对产热脂肪细胞分化和功能的影响
确定RUNX1/2对棕色脂肪细胞分化、产热基因表达和线粒体功能的作用
在棕色前脂肪细胞中过表达RUNX1/2或使用CRISPR/Cas9敲除RUNX1/2，诱导分化后检测产热基因、线粒体呼吸链蛋白、OCR、细胞温度和线粒体膜电位。
体内验证RUNX1/2在适应性产热和能量代谢中的作用
评估脂肪细胞特异性或产热脂肪细胞特异性RUNX1/2缺失对冷耐受和全身能量代谢的影响
构建Adipoq-Cre介导的RUNX1/2 AKO小鼠和Ucp1-Cre介导的RUNX1/2 UKO小鼠，进行冷暴露实验、间接测热法、组织学分析和基因表达检测。
解析RUNX1/2直接基因组结合和表观遗传抑制机制
确定RUNX1/2是否直接结合产热基因调控区域以及是否通过HDAC1介导表观沉默
在iWAT中进行CUT&Tag和ChIP-seq，结合RNA-seq分析直接靶基因；Co-IP检测RUNX1/2与HDAC1相互作用；HDAC1敲除挽救实验；H3K27ac CUT&Tag。
探究RUNX2相分离在产热基因调控中的作用
验证RUNX2通过液-液相分离抑制产热基因程序的机制
在U2OS细胞中表达GFP标记的RUNX1/2观察凝聚体；FRAP分析；构建RUNX2 ΔIDR和FUS-IDR突变体，在RUNX2 KO棕色脂肪细胞中验证功能；免疫荧光共定位分析。
评估RUNX1/2药理抑制对脂肪产热和能量代谢的影响
测试RUNX1/2小分子抑制剂能否增强脂肪产热并改善代谢
在分化棕色脂肪细胞中给予RO5-3335或CADD522，检测UCP1和OCR；小鼠每日腹腔注射抑制剂1周后进行冷暴露实验、基因表达和组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | C11965500BT |
| 胎牛血清 | Lonsera | S712-012S | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I8280 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| 产热检测 | ERthermAC | EMD Millipore | SCT057 |
| OCR检测 | 寡霉素 | MCE | HY-N6782 |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| 药物处理 | RO5-3335 | TargetMol | T4687 |
| CADD522 | TargetMol | T8334 | |
| 动物实验 | CL-316,243 | MCE | HY-116771A |
| Western blot | 兔抗UCP1抗体 | Abcam | ab10983 |
| 兔抗RUNX1抗体 | Proteintech | 25315-1-AP | |
| 兔抗RUNX2抗体 | CST | 8486S | |
| 鼠抗HDAC1抗体 | Abcam | ab7028 | |
| 鼠抗OXPHOS抗体 | Abcam | ab110413 | |
| 兔抗AKT抗体 | CST | 9272S | |
| 兔抗磷酸化AKT (S473)抗体 | CST | 4060S | |
| 鼠抗PPARγ抗体 | Santa Cruz | sc-7273 | |
| 兔抗P300抗体 | Abcam | ab275378 | |
| 兔抗HDAC2抗体 | Abcam | ab32117 | |
| 兔抗HSP90抗体 | Abmart | T55548M | |
| 鼠抗VINCULIN抗体 | CST | 18799S | |
| 兔抗CD45抗体 | Abmart | PA6232S | |
| 兔抗脂联素抗体 | Abcam | ab22554 | |
| 兔抗β3-微管蛋白抗体 | CST | 5568 | |
| 兔抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 81115-1-RR | |
| 兔抗RXRα抗体 | Abmart | T58640S | |
| 抗兔IgG二抗 | CST | 7074S | |
| 抗鼠IgG二抗 | CST | 926-32210 | |
| CUT&Tag | 兔抗H3K27AC抗体 | Abcam | ab4729 |
| 兔抗EP300抗体 | CST | 86377 | |
| ChIP | 兔抗RUNX1抗体 | Abcam | ab23980 |
| 免疫荧光 | PDGFRα抗体 | R&D Systems | AF-307-NA |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| qPCR | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R323-01 |
| SYBR-Green PCR预混液 | Vazyme | Q711-03 | |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Aidlab | RN2801 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Selleck | B14002 | |
| 细胞培养 | 潮霉素B | Selleck | S2908 |
| 嘌呤霉素 | Selleck | S7417 | |
| 杀稻瘟菌素 | Selleck | S7419 | |
| 组织学 | DAB显色 | Vector Laboratories | SK-4105 |
| 脂质染色 | 尼罗红 | Sigma | N3013 |
| 改良油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1261 | |
| 甘油三酯测定 | 甘油三酯含量测定试剂盒 | Sangon Biotech | D799795 |
| ELISA | 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Abmart | AB-B215511 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| Co-IP | 细胞核分离试剂盒 | Sigma-Aldrich | NUC101 |
| Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10002D | |
| CUT&Tag | NovoNGS CUT&Tag 2.0A高灵敏度试剂盒 | Novoprotein Scientific | N259-YH01-01A |
| 抗兔IgG二抗 | Novoprotein | N269-01A | |
| RNA-seq | Fast RNA-seq文库制备试剂盒V2 | -- | RK2030 |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库制备试剂盒V2（Illumina） | Vazyme | TD501–503 |
| ChIP | MinElute反应纯化试剂盒 | QIAGEN | -- |
| VAHTS Turbo DNA文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme Biotech | -- | |
| 设备 | Seahorse XFe细胞外流量分析仪 | Agilent | -- |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | BioRad | -- | |
| Axio Scan Z1数字切片扫描仪 | Carl Zeiss | -- | |
| Zeiss LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Promethion代谢笼系统 | Sable Systems | -- | |
| FT3400温度计 | Suzhou snsek | FT3400 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 冷暴露实验 | 热中性30°C适应2周，4°C冷暴露，每小时测直肠温度；体温下降≥10°C即终止 阅读提示：Methods 'Cold tolerance test'；Fig. 3a-d、Fig. 4a-d |
| CL316243刺激的间接测热法 | CL316243剂量1 mg/kg（腹腔注射），热中性适应2-3周；代谢笼分析中CL剂量0.1 mg/kg 阅读提示：Methods 'Metabolic cage analysis'；Fig. 3i-l、Fig. 4i-l |
| HFD代谢实验 | 7周龄雄性小鼠，HFD（60% kcal脂肪，D12492）12周；GTT葡萄糖剂量0.75 g/kg，ITT胰岛素1.25 U/kg 阅读提示：Methods 'Animal studies'、'Glucose tolerance test (GTT) and insulin tolerance test (ITT)'；Fig. 3q-t |
| 脂肪细胞分化 | 棕色脂肪细胞：诱导3天（1 μg/mL胰岛素、1 nM T3、125 nM吲哚美辛、0.5 mM IBMX、1 μM罗格列酮、1 μM Dex），维持4天；米色脂肪细胞：诱导3天（1 μM Dex、0.5 mM IBMX、1 μM罗格列酮、1 μg/mL胰岛素），维持4天 阅读提示：Methods 'Cell culture' |
| 药理抑制实验 | 体外10 μM RO5-3335或CADD522；体内RO5-3335 10 mg/kg或CADD522 10 mg/kg每日腹腔注射1周 阅读提示：Methods 'Animal studies'；Fig. 8a-n |
| RUNX2相分离实验 | U2OS细胞转染RUNX2-GFP；FRAP分析；RUNX2突变体（WT、ΔIDR、FUS-IDR）在RUNX2 KO棕色脂肪细胞中验证 阅读提示：Fig. 7b-g；Methods 'Plasmid construction for gene knockout and overexpression' |