TnpB-ωRNA系统工程化改造
获得哺乳动物细胞兼容的高效紧凑基因调控工具
对人源密码子优化的ISDra2 TnpB引入D191A突变生成dTnpB，融合VPR和SV40-NLS；对ωRNA进行M1-M5修饰策略筛选，结合M1-116、M2.4和M3.9获得enωRNA；对dTnpB进行三轮精氨酸突变筛选，获得N255R/P282R双突变endTnpB。
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微型多功能基因组调控TnpB-ωRNA工具包助力癌症免疫治疗
Miniature and versatile genome regulation TnpB-ωRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy.
实验完整度
高包含报告基因筛选、内源基因激活、RNA-seq、GUIDE-seq、类器官、人源化小鼠模型及体内功能验证
主要模型
HEK293T细胞系 UM-UC-3和T24膀胱癌细胞系 患者来源膀胱癌类器官 PBMC重建的UM-UC-3人源化小鼠模型
重点核对
报告基因激活实验使用800 ng报告质粒、800 ng TnpB变体质粒和800 ng ωRNA变体质粒共转染HEK293T细胞，转染后48 h检测 内源基因激活实验使用1000 ng全合一线性质粒转染HEK293T细胞，转染后48 h检测mRNA表达 GUIDE-seq在FANCA、SERPINA1和VEGFA三个位点评估GE#1脱靶效应，允许最多5个错配 类器官共培养：AAV-NT或AAV-ImmunAct处理5天，与自体CD8⁺ T细胞（1×10⁵/孔）共培养18 h后检测细胞死亡 人源化小鼠模型：NCG小鼠皮下接种5×10⁶ UM-UC-3细胞，尾静脉注射1×10⁷活化PBMC，瘤内注射1×10¹⁰ vg AAV，腹腔注射10 mg/kg αPD1，每组n=7
摘要
CRISPR–Cas系统是强大的基因组调控工具。然而，Cas蛋白尺寸较大，限制了其通过腺相关病毒（AAV）的高效递送，从而制约了临床转化。本文中，我们对IS200/IS605转座子编码的核酸酶TnpB及其ωRNA支架进行工程化改造，构建了增强型TnpB系统，作为基因激活、基因组编辑和碱基编辑的紧凑工具包。基因激活器enTnpBa使用最小化的93 nt ωRNA使表达提高2889倍，并在哺乳动物细胞中稳健激活内源基因。我们开发了一种基于单AAV的免疫激活方案（AAV-ImmunAct），递送enTnpBa以激活CXCL9、IL-15和IFN-γ。AAV-ImmunAct有效增强T细胞迁移和激活，增加对癌细胞系和患者来源类器官的杀伤，并在人源化小鼠中与抗PD-1治疗产生协同作用。本文中，我们确立了enTnpB作为紧凑多功能基因组调控平台及癌症免疫治疗的有前景工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否将紧凑的TnpB-ωRNA系统工程化为高效的基因组调控工具，并用于癌症免疫治疗？
- 核心机制
- enTnpB通过改造的ωRNA和TnpB蛋白变体增强DNA靶向和转录激活，单AAV递送enTnpBa激活CXCL9、IL-15和IFN-γ表达，增强CD8⁺ T细胞浸润和杀伤功能。
- 主要证据
- 报告基因激活提高2889倍；内源基因IFN-γ激活达1308倍；RNA-seq和GUIDE-seq显示低脱靶；AAV-ImmunAct增强T细胞迁移和GZMB表达，增加癌细胞系和患者类器官杀伤；人源化小鼠中与抗PD-1协同抑制肿瘤。
- 研究意义
- enTnpB作为紧凑多功能基因组调控平台，AAV-ImmunAct为癌症免疫治疗提供有前景的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
enTnpBa基因激活效率与特异性验证
比较enTnpBa与CasMINIa的激活效率和特异性
构建全合一线性质粒，转染HEK293T细胞，流式检测mOrange2 MFI；RNA-seq分析脱靶；内源基因IFN-γ、CXCL9、CD48、IL-15激活用RT-qPCR检测。
enTnpB基因编辑和碱基编辑工具开发
评估enTnpB用于基因编辑和碱基编辑的能力
构建GE#1（enωRNA+WT TnpB）、GE#2（enωRNA+endTnpB）和ABE#1、ABE#2等，在HEK293T细胞中检测indel效率和A-to-G转换；GUIDE-seq和扩增子测序评估脱靶。
AAV-ImmunAct体外免疫激活验证
验证单AAV递送enTnpBa激活细胞因子并增强T细胞杀伤
构建AAV-ImmunAct包装enTnpBa和靶向CXCL9、IFN-γ、IL-15的ωRNA阵列；转染HEK293T细胞检测蛋白表达；上清处理CD8⁺ T细胞评估迁移和GZMB；AAV-ImmunAct处理膀胱癌细胞系和患者类器官后与CD8⁺ T细胞共培养检测杀伤。
AAV-ImmunAct体内抗肿瘤疗效评估
评估AAV-ImmunAct单用及联合抗PD-1的体内疗效
建立PBMC重建的UM-UC-3人源化小鼠模型，分组给予AAV-NT、AAV-NT+αPD1、AAV-ImmunAct、AAV-ImmunAct+αPD1，监测肿瘤生长，终点分析Ki-67、TUNEL、CD8和GZMB。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | Phanta Flash Master Mix | Vazyme | P510 |
| FastPure凝胶DNA提取迷你试剂盒 | Vazyme | DC301 | |
| ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒 | Vazyme | C115 | |
| SpeI-HF限制性内切酶 | New England Biolabs | R3133S | |
| SnaBI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0130L | |
| NotI限制性内切酶 | New England Biolabs | R3189L | |
| BamHI-HF限制性内切酶 | New England Biolabs | R3136S | |
| PaqCI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0745L | |
| T4连接酶 | New England Biolabs | M0202L | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher | 11965092 |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 细胞培养转染 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher | 11058021 |
| 线性聚乙烯亚胺 | Yeasen | 40816ES02 | |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 抗人CD8抗体 | BioLegend | 980910 | |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| 抗人颗粒酶B抗体 | BioLegend | 515403 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | 9109 |
| HiScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R212-01 | |
| ChamQ SYBR Color qPCR预混液 | Vazyme | Q411-02 | |
| LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| ELISA | 人CXCL9 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00165 |
| 人IFN-γ ELISA试剂盒 | BioLegend | 430116 | |
| 人IL-15 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00102 | |
| Synergy H1酶标仪 | BioTek | -- | |
| Western blot | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| 抗人CXCL9抗体 | Proteintech | 22355-1-AP | |
| 抗人IFN-γ抗体 | Proteintech | 15365-1-AP | |
| 抗人IL-15抗体 | Abcam | ab40668 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab7291 | |
| HRP标记二抗 | Abcam | ab205719 | |
| UltraSignal ECL试剂盒 | 4Abio | 4AW011-100 | |
| 类器官培养 | II型胶原酶 | Worthington | -- |
| DNase I | Worthington | -- | |
| Y-27632 | MCE | HY-10071 | |
| HEPES | Gibco | 15630106 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| B27添加剂 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 烟酰胺 | MCE | HY-B0150 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | MCE | HY-B0215 | |
| SB202190 | MCE | HY-10295 | |
| A83-01 | MCE | HY-10432 | |
| R-spondin 1 | SinoBiological | 11083-HNAS | |
| 肝细胞生长因子 | SinoBiological | 10463-HNAS | |
| FGF4 | Novoprotein | CR08 | |
| FGF10 | SinoBiological | 10573-HNAE | |
| AAV纯化 | 碘克沙醇 | Sigma-Aldrich | 92339-11-2 |
| T细胞杀伤检测 | SYTOX Green试剂盒 | KeyGEN | KGE2504-500 |
| 类器官杀伤检测 | 细胞增殖染料eFluor™ 450 | Thermo Fisher | 65-0842-85 |
| NucRed Dead 647 ReadyProbe试剂 | Thermo Fisher | R37113 | |
| T细胞迁移检测 | CFSE | Thermo Fisher | 65-0850-84 |
| Transwell小室（3 µm孔径） | Falcon | 353096-8EA | |
| T7EI实验 | T7核酸内切酶I | New England Biolabs | M0302S |
| 免疫组化 | 抗人Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | 9449 |
| 抗人CXCL9抗体 | Cell Signaling Technology | 9449 | |
| 抗人IFN-γ抗体 | Proteintech | 15365-1-AP | |
| 抗人IL-15抗体 | Abcam | ab55276 | |
| SA-HRP TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1507-50T | |
| 免疫荧光 | 抗人CD8α抗体 | Cell Signaling Technology | 70306 |
| 抗人颗粒酶B抗体 | Cell Signaling Technology | 17215 | |
| 荧光标记二抗 | Proteintech | SA00009-1 | |
| 荧光标记二抗 | Proteintech | SA00003-2 | |
| DAPI | Solarbio | C0065-50 | |
| 小鼠免疫重建 | 人CD3/CD28 T细胞活化磁珠 | BioLegend | 422603 |
| gDNA提取 | FastPure细胞/组织DNA分离迷你试剂盒 | Vazyme | DC102-01 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 报告基因激活实验 | 质粒用量（800 ng报告质粒、800 ng TnpB变体质粒、800 ng ωRNA变体质粒或1000 ng全合一线性质粒）、转染试剂比例（质粒:PEI=2:1 w:w）、检测时间（48 h）、细胞系（HEK293T） 阅读提示：Methods中“Cell culture and transfection”小节 |
| 内源基因激活实验 | 靶基因（IFN-γ、CXCL9、CD48、IL-15）、spacer数量（每个基因5条）、检测方法（RT-qPCR）、转染后48 h检测 阅读提示：Methods中“Cell culture and transfection”和“Quantitative RT-PCR”小节，Fig. 4f–i图注 |
| GUIDE-seq脱靶分析 | 靶位点（FANCA、SERPINA1、VEGFA）、错配允许数（最多5个）、电转条件、测序平台（MGI2000） 阅读提示：Methods中“Off-target effects analysis”小节 |
| AAV-ImmunAct体外T细胞杀伤实验 | AAV滴度（10⁸ vg/孔）、处理时间（3天）、CD8⁺ T细胞数量（1×10⁵/孔）、共培养时间（24 h）、杀伤检测方法（SYTOX Green流式） 阅读提示：Methods中“Coculture of human CD8⁺ T cells with bladder cancer cell lines and organoids”小节，Fig. 6g–h图注 |
| 患者来源类器官共培养实验 | 类器官来源患者数量（文中提到6例建立，但共培养实验使用3例）、AAV处理时间（5天）、自体CD8⁺ T细胞数量（1×10⁵/孔）、共培养时间（18 h）、细胞死亡检测（NucRed Dead 647 MFI） 阅读提示：Methods中“Coculture of human CD8⁺ T cells with bladder cancer cell lines and organoids”小节，Fig. 6i–j图注 |
| 人源化小鼠体内实验 | 小鼠品系（NCG，5周龄雄性）、UM-UC-3细胞接种量（5×10⁶）、PBMC活化方法（CD3/CD28磁珠72 h）和注射量（1×10⁷）、AAV剂量（1×10¹⁰ vg/只）和注射时间（第12、18天）、αPD1剂量（10 mg/kg）和给药频率（每3天一次）、分组（4组，每组n=7）、肿瘤体积测量公式（½×L×W²） 阅读提示：Methods中“Establishment of humanized subcutaneous mouse models”小节，Fig. 7a图注 |
| ωRNA工程化筛选 | 修饰策略（M1-M5）、报告基因（mOrange2）、流式检测MFI、n=3独立生物学重复 阅读提示：Results中“Engineering the cognate ωRNA scaffold for gene activation”小节，Fig. 2图注 |
| dTnpB蛋白工程化筛选 | 第一轮22个精氨酸突变、第二轮N255R组合突变、第三轮筛选、报告基因激活倍数计算（MFI比值）、n=3独立生物学重复 阅读提示：Results中“Development of the endogenous gene activator enTnpBa by engineering dTnpB”小节，Fig. 3图注 |