细胞核质分离与RNA提取
获得纯化的细胞核和细胞质RNA组分，以空间分辨pre-rRNA加工事件。
HEK293细胞经胰酶消化、NIB缓冲液重悬、匀浆和离心，细胞质上清收集，核沉淀经Optiprep密度梯度离心纯化，DAPI染色评估核质量，TRIzol提取RNA。
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利用长读长纳米孔测序以单核苷酸分辨率绘制人类前体rRNA加工与修饰图谱
Mapping human pre-rRNA processing and modification at single nucleotide resolution using long read nanopore sequencing.
实验完整度
高包含HEK293细胞核质分离、cDNA和直接RNA纳米孔测序、因子敲低、northern印迹验证及修饰分析等多层验证。
主要模型
HEK293细胞核质分离组分 HEK293细胞全细胞RNA HEK293细胞核仁/核质/细胞质PSE组分 HCT116 p53阳性细胞突变体
重点核对
HEK293细胞中UTP18、WBSCR22、LAS1L敲低48小时，DIMT1L、URB1、RPL3敲低72小时 核质分离使用Optiprep密度梯度离心，100×g和20,817×g离心条件 cDNA纳米孔测序前进行体外poly(A)加尾 直接RNA测序使用SQK-RNA004试剂盒 所有分析进行三次生物学重复（R1-R3）
摘要
核糖体生物发生需要前体rRNA（pre-rRNA）的合成及其依次加工为成熟rRNA。传统方法如northern印迹和代谢标记分辨率有限。在此，我们提出NanoRibolyzer，一种基于纳米孔的长读长测序方法，能够从头鉴定和定量rRNA前体，同时绘制RNA修饰图谱。利用监督和无监督映射，我们检测到已知和先前未表征的pre-rRNA，并以单核苷酸分辨率描绘切割事件。简单的细胞分级分离方案进一步分离核和细胞质pre-rRNA，允许对加工途径进行空间解卷积。通过使用起始和终止坐标将每个测序分子投射到二维空间，我们生成了一种直观的表示，其中5′→3′和3′→5′外切核糖核酸酶活性可随着它们一个核苷酸一个核苷酸地成熟pre-rRNA而被追踪。核糖体组装因子的靶向敲低可定量中间体的积累，并揭示具有生物标志物潜力的条件特异性加工“指纹”。对已知因子的高分辨率重新分析揭示了意想不到的功能。此外，假尿苷映射显示初级47S转录本被广泛修饰，而异常中间体（34S和36S-C）则修饰不足。凭借其高分辨率和独特的发现模式，NanoRibolyzer为rRNA加工和修饰提供了新见解，极大地推进了我们对核糖体生物发生的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何以单核苷酸分辨率全面检测和定量人类pre-rRNA中间体，同时映射RNA修饰并解析其空间动态？
- 核心机制
- NanoRibolyzer通过将长读长纳米孔测序读取比对到单个45SN1参考模板，结合监督和无监督映射策略，实现pre-rRNA加工位点和修饰的单核苷酸分辨率分析。
- 主要证据
- 在HEK293细胞核质分离组分中，cDNA和直接RNA测序检测到已知和新型pre-rRNA，验证了已知加工因子功能并揭示新功能，假尿苷映射显示47S已被广泛修饰而34S和36S-C修饰不足。
- 研究意义
- NanoRibolyzer为研究核糖体生物发生提供了高分辨率、多功能平台，有望应用于基础研究、疾病机制研究（包括核糖体病和肿瘤发生）以及临床诊断。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
pre-rRNA的纳米孔cDNA测序
检测和定量核质组分中的pre-rRNA中间体。
RNA经体外poly(A)加尾，使用Direct cDNA Sequencing Kit和Native Barcoding Expansion构建文库，PromethION测序。
监督和无监督映射分析pre-rRNA
以单核苷酸分辨率鉴定加工位点和定量pre-rRNA中间体。
将长读长比对到45SN1参考序列，监督方法基于最小相互重叠将读取分配给已知中间体，无监督方法构建起始和终止坐标的二维强度矩阵。
核糖体组装因子敲低及表型验证
评估NanoRibolyzer检测pre-rRNA加工扰动的能力并验证因子功能。
siRNA反向转染HEK293细胞敲低UTP18、DIMT1L、WBSCR22、LAS1L、URB1、RPL3和RPS26，northern印迹验证后选择最佳时间点进行纳米孔测序。
直接RNA测序及RNA修饰分析
检测天然RNA分子上的碱基修饰和假尿苷，并分析其空间动态。
使用SQK-RNA004试剂盒构建直接RNA文库，PromethION测序，Dorado PseU basecaller定量假尿苷，Remora分析原始信号。
前核糖体顺序提取（PSE）及亚细胞组分测序
获得核仁、核质和细胞质组分以解析pre-rRNA加工和修饰的时空动态。
按已发表PSE方法分离SN1（细胞质）、SN2（核质）、SN3（核仁）组分，Western blot验证标记蛋白，进行cDNA和直接RNA测序。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 核质分离 | Optiprep溶液 | Stemcell technologies | 07820 |
| TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596026 | |
| DNase I | NEB | -- | |
| RNA提取 | 氯仿 | -- | -- |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 乙醇 | -- | -- | |
| PSE分级分离 | cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| RNasin | Promega | -- | |
| 无RNase DNase I | Qiagen | -- | |
| TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596026 | |
| Western blot | 抗组蛋白H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP |
| 抗核仁素抗体 | Proteintech | 10556-1-AP | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| HRP标记抗兔二抗 | Cytiva | NA934V | |
| 抗纤维蛋白抗体 | Antibodies-online | ABIN361375 | |
| 抗UBF抗体 | Tebu Bio | SC-13125 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-062 | |
| 体外poly(A)加尾 | RNA poly(A)加尾体外多聚腺苷酸化试剂盒 | NEB | M0276 |
| RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| 体外转录 | HiScribe T7高产率RNA合成试剂盒 | -- | -- |
| DNase I | ThermoFisher Scientific | EN0525 | |
| Monarch RNA纯化试剂盒 | NEB | T2040 | |
| cDNA纳米孔测序建库 | 直接cDNA测序试剂盒 | ONT | SQK-DCS109 |
| 天然条形码扩展1-24 | ONT | EXP-NBD104, EXP-NBD114 | |
| VNP | ONT | -- | |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| 5×RT缓冲液 | ThermoFisher | EP0751 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777019 | |
| 链转换引物 | ONT | -- | |
| Maxima H Minus逆转录酶 | ThermoFisher | EP0751 | |
| RNase混合物酶混合液 | ThermoFisher | AM2286 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 2×LongAmp Taq预混液 | NEB | N0447 | |
| PR2引物 | ONT | -- | |
| Ultra II末端修复反应缓冲液 | NEB | E7546 | |
| Ultra II末端修复酶 | NEB | E7546 | |
| 天然条形码 | ONT | -- | |
| 平末端/TA连接酶预混液 | NEB | M0367 | |
| 接头混合物II | ONT | -- | |
| 5×NEBNext快速连接反应缓冲液 | NEB | B6058 | |
| Quick T4 DNA连接酶 | NEB | E6056 | |
| 直接RNA测序建库 | SQK-RNA004试剂盒 | ONT | -- |
| NEBNext快速连接反应缓冲液 | NEB | B6058 | |
| RT接头 | ONT | -- | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| 5×第一链缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| DTT | -- | -- | |
| SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNA连接接头 | ONT | -- | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| 洗涤缓冲液 | ONT | -- | |
| 洗脱缓冲液 | ONT | -- | |
| siRNA敲低 | 针对UTP18的Silencer Select siRNA | Ambion | -- |
| 针对WBSCR22的Silencer Select siRNA | Ambion | -- | |
| 针对DIMT1L的Silencer Select siRNA | Ambion | -- | |
| 针对LAS1L的Silencer Select siRNA | Ambion | -- | |
| 针对URB1的DsiRNA | IDT | -- | |
| 针对RPL3的DsiRNA | IDT | -- | |
| 针对RPS26的DsiRNA | IDT | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞核质分离 | HEK293细胞培养条件：DMEM含10% FBS和1% L-glutamine，37°C、5% CO2；NIB缓冲液成分和离心参数（100×g 5分钟，20,817×g 20分钟） 阅读提示：Methods中“Simplified nuclei isolation protocol”及Supplementary Fig. S1 |
| siRNA敲低 | siRNA浓度10 nM（URB1为15 nM）、转染时间点（UTP18/WBSCR22/LAS1L为48小时，DIMT1L/URB1/RPL3为72小时）及对照设置 阅读提示：Methods中“siRNA inactivation experiments”及Fig. 4B |
| cDNA纳米孔测序 | 1 μg RNA进行poly(A)加尾，使用SQK-DCS109和EXP-NBD104/114建库，PromethION测序 阅读提示：Methods中“Direct cDNA-native barcoding library preparation” |
| 直接RNA测序 | 1 μg poly(A)加尾RNA，SQK-RNA004建库，Dorado PseU basecaller分析，修饰概率阈值95% 阅读提示：Methods中“Direct RNA library preparation”和“DRS modification analysis” |
| PSE分级分离 | SN1、SN2、SN3缓冲液成分及离心参数，Western blot标记蛋白验证 阅读提示：Methods中“Pre-ribosomal sequential extraction method (PSE)”及Fig. S22A |