构建等位基因标记报告细胞系
监测APP、FMR1、MECP2和SIN3A的等位基因表达。
利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复，在WTC11 i3N iPSC中将EGFP和/或mCherry报告基因标记到目标基因C端，通过FACS分选单细胞和基因型鉴定建立克隆报告细胞系。
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CRISPR平铺缺失筛选揭示SIN3A转录的功能增强子及等位基因补偿效应（ACE）
CRISPR tiling deletion screens reveal functional enhancers and allelic compensation effects (ACE) on SIN3A transcription.
实验完整度
高包含人iPSC诱导神经元CRISPR筛选、单克隆验证、FACS、RT-qPCR、ChIP-qPCR及启动子报告等多层功能与机制验证
主要模型
WTC11 i3N iPSC报告细胞系 iPSC诱导的兴奋性神经元 HEK293T细胞
重点核对
CRISPR平铺缺失筛选：每个基因2次独立筛选，约500,000个低表达细胞分选 增强子单克隆验证：FACS分选单细胞，每个基因型随机选2个克隆 SIN3A等位基因表达分析：基于SNP（chr15:75374632, C/T）的深度测序 SIN3A启动子报告实验：P1和P1+P2报告，SIN3A shRNA敲低，3个生物学重复 ChIP-qPCR检测SIN3A与启动子结合：3个生物学重复
摘要
精确的转录调控对细胞功能和发育至关重要，但许多基因的这一过程机制仍不清楚。为了更深入理解神经精神疾病风险基因的调控，我们在人诱导多能干细胞（iPSC）诱导的兴奋性神经元中，利用CRISPR平铺缺失筛选，为四个剂量敏感基因APP、FMR1、MECP2和SIN3A共鉴定出39个功能增强子。更重要的是，我们发现SIN3A的等位基因增强子缺失可通过另一条完整等位基因转录活性增加来补偿。这种等位基因补偿效应（ACE）在分化过程中稳定维持，且一旦建立，无法通过外源SIN3A表达逆转。此外，SIN3A的ACE通过启动子对剂量的感知而发生。总之，我们的发现揭示了一种调控补偿机制，确保SIN3A以及其他潜在剂量敏感基因的稳定精确转录输出。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- APP、FMR1、MECP2和SIN3A等剂量敏感神经精神疾病风险基因的功能增强子如何调控其转录，以及增强子缺失后细胞如何维持剂量敏感基因的精确转录输出。
- 核心机制
- SIN3A等位基因增强子缺失导致顺式等位基因SIN3A表达显著降低，降低的SIN3A蛋白对自身启动子的结合减少，通过启动子剂量感知触发反式完整等位基因的转录上调，即等位基因补偿效应（ACE）；ACE一旦建立可稳定遗传且不能被外源SIN3A表达逆转。
- 主要证据
- 在WTC11 i3N iPSC及其诱导的兴奋性神经元中，CREST-seq筛选鉴定出39个功能增强子；SIN3A-E2/E3/E4/E5增强子缺失均诱导ACE；SNP等位基因表达分析和RT-qPCR显示总SIN3A mRNA不变；启动子报告和ChIP-qPCR证明SIN3A启动子介导剂量感知。
- 研究意义
- 揭示了一种由增强子丢失触发、经启动子感知和转录上调介导的剂量补偿机制，扩展了负反馈调控框架，并可能解释剂量敏感基因增强子扰动不影响细胞和发育过程的现象，为理解SIN3A单倍剂量不足相关疾病提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR平铺缺失筛选鉴定增强子
无偏鉴定四个基因周围的功能增强子。
设计配对sgRNA文库，慢病毒转导报告iPSC，嘌呤霉素筛选后分化为兴奋性神经元，FACS分选报告基因表达降低的细胞，深度测序pgRNA并利用RELICS分析鉴定增强子。
增强子功能验证
验证筛选鉴定的增强子对靶基因表达的调控作用。
利用配对sgRNA介导的CRISPR缺失，在报告iPSC和分化神经元中删除候选增强子或启动子，通过流式细胞术检测报告基因表达变化，并对SIN3A和MECP2建立单细胞克隆验证。
ACE现象发现与等位基因分析
确定增强子缺失是否诱导反式等位基因补偿及总SIN3A表达是否维持。
在SIN3A-EGFP/mCherry报告细胞中删除SIN3A-E4等增强子，流式检测双等位基因表达；利用SIN3A内含子SNP进行等位基因表达深度测序分析，RT-qPCR检测总SIN3A mRNA。
ACE动态过程与可逆性分析
追踪ACE的时间动态，并测试已建立ACE能否被外源SIN3A表达逆转。
在SIN3A-E4或启动子缺失后多个时间点流式检测等位基因表达变化；在SIN3A-E4缺失克隆中外源表达CAG或SIN3A启动子驱动的SIN3A，计算补偿指数（CI）。
启动子介导剂量感知机制验证
验证SIN3A启动子是否通过SIN3A自身结合感知剂量并启动ACE。
构建SIN3A P1和P1+P2启动子EGFP报告，利用shRNA敲低内源SIN3A后流式检测报告活性；ChIP-qPCR检测SIN3A在启动子区域的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 报告细胞系构建 | Gibson组装试剂盒 | NEB | E2621S |
| sgRNA体外转录 | Precision gRNA合成试剂盒 | Invitrogen | A29377 |
| 核转染 | 核转染试剂盒 | Lonza | VPH-5012 |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354277 |
| Essential 8培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| 细胞传代 | Accutase细胞消化液 | STEMCELL Technologies | 07920 |
| 细胞培养 | ROCK抑制剂Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 11995065 | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30396.03 | |
| 细胞传代 | 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-218 |
| 神经元分化 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| pgRNA文库扩增 | NEBNext高保真2×PCR预混液 | NEB | M0541S |
| pgRNA文库克隆 | lentiCRISPRv2质粒 | Addgene | 52961 |
| NEB 5-α电转感受态大肠杆菌 | NEB | C2989K | |
| Qiagen无内毒素质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12381 | |
| T4连接酶 | NEB | M0202M | |
| 慢病毒包装 | psPAX包装质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| PolyJet转染试剂 | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| 病毒浓缩 | Millex-HV 0.45 μm聚偏二氟乙烯滤器 | Millipore | SLHV033RS |
| Amicon Ultra-15离心过滤单元（100,000 NMWL） | Amicon | UFC910008 | |
| 病毒滴定 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003-G |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 神经元解离 | 木瓜蛋白酶 | Sigma | P4762 |
| DNase Ⅰ | Sigma | DN25 | |
| 细胞重悬 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 11330032 |
| HBSS缓冲液 | Gibco | 14175095 | |
| DNA沉淀 | 异丙醇 | Fisher Scientific | BP2618500 |
| RNA提取 | QIAGEN plus mini RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 |
| RT-qPCR | Luminaris HiGreen qPCR预混液 | Thermo Scientific | K0992 |
| 基因组DNA提取 | QuickExtract DNA提取液 | Biosearch Technologies | QE0905T |
| PCR扩增 | TaKaRa LA Taq DNA聚合酶 | TaKaRa | RR042A |
| TOPO克隆 | TOPO克隆试剂盒 | Invitrogen | 450071 |
| ChIP-qPCR | 抗SIN3A抗体 | Novus Biologicals | NB600-1263 |
| 抗IgG抗体 | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Dynabeads Protein A磁珠 | Invitrogen | 10001D | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| RNase | NEB | T3018L | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| 流式分析 | BD LSR II流式细胞仪 | BD | -- |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| 流式分选 | BD FACSAria II仪器 | BD | -- |
| qPCR检测 | Roche LightCycler 96仪器 | Roche | -- |
| ChIP超声破碎 | Covaris S220聚焦超声仪 | Covaris | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR平铺缺失筛选 | pgRNA文库覆盖率（每个核苷酸15×或20×）、MOI 0.5、嘌呤霉素500 ng/mL筛选7天、分化2周后分选低表达细胞数（约500,000）、每个基因2次独立筛选 阅读提示：Methods中CREST-seq screen小节及Supplementary Methods |
| 增强子功能验证 | 每个区域2条sgRNA、嘌呤霉素500 ng/mL处理7天、iPSC感染后7天流式分析、神经元分化14天后流式分析、单细胞克隆随机选2个 阅读提示：Methods中Validation of identified enhancers小节及图2、图3图注 |
| SIN3A等位基因表达分析 | SNP位点chr15:75374632 (C/T, hg38)、深度测序窗口21 bp、每个基因型2个独立克隆、每个克隆3个生物学重复 阅读提示：Methods中RT-qPCR and allelic gene expression小节及图3图注 |
| 启动子报告与ChIP-qPCR | P1和P2启动子区域坐标、shRNA敲低效率、ChIP-qPCR抗体用量2.5 μg、3个生物学重复、数据以input归一化 阅读提示：Methods中SIN3A promoter reporter assay和ChIP-qPCR小节及图5图注 |
| ACE时间进程与可逆性 | 感染后时间点设置、外源SIN3A表达水平（CAG>3倍，SIN3A启动子约1.7倍）、补偿指数CI计算方式、2个独立克隆 阅读提示：Methods中Time-course analysis of SIN3A transcriptional compensation和The overexpression of SIN3A小节及图4图注 |