高糖诱导ADSL-INSIG1/2相互作用的鉴定
确定高糖条件下与INSIG1/2结合的蛋白及其结合条件。
在高糖培养的Huh7细胞中免疫沉淀Flag-INSIG1/INSIG2，质谱鉴定结合蛋白，并用免疫共沉淀和细胞分级验证ADSL与INSIG1/2的结合及内质网转位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ADSL的兼职功能介导的INSIG1/2琥珀酰化促进脂肪生成和肝脏肿瘤发生
INSIG1/2 succination mediated by the moonlighting function of ADSL promotes lipogenesis and liver tumorigenesis.
实验完整度
高涵盖HCC细胞系、基因编辑细胞、小鼠移植瘤与转基因模型、患者HCC样本及多组学与分子模拟验证
主要模型
Huh7人肝细胞癌细胞系 HCCLM3人肝细胞癌细胞系 athymic BALB/c nude小鼠皮下及肝内移植瘤模型 FVB/N小鼠AKT/c-Met hydrodynamic转基因HCC模型
重点核对
高糖处理浓度25 mM，低糖预处理1.25 mM 16 h；抑制剂预处理30 min ADSL S407A/S407D、A291V等突变体在ADSL敲低细胞中的回补表达 INSIG1 C167S/INSIG2 C111S及C167D/C111D CRISPR/Cas9敲入细胞 小鼠移植瘤每组n=6，接种后28天评估肿瘤体积 Elsulfavirine 10 mg/kg每日灌胃，联合Lenvatinib 10 mg/kg每日灌胃20天
摘要
有氧糖酵解支持肿瘤生长，但肿瘤细胞如何感知葡萄糖以协调生物合成仍 largely 不清楚。本文中我们表明，在肝细胞癌细胞中，葡萄糖激活的PKCε磷酸化嘌呤合成酶ADSL，触发其转位至内质网。ADSL随后促进INSIG1/2的琥珀酰化，破坏INSIG蛋白与SCAP之间的相互作用，导致SCAP-SREBP复合物转位至高尔基体、SREBP-1激活以及下游脂肪生成相关基因转录、肿瘤细胞增殖和小鼠肿瘤发生。通过虚拟筛选，我们鉴定出Elsulfavirine，一种已获批的HIV药物，其阻断ADSL-INSIG相互作用并抑制葡萄糖诱导的SREBP-1激活。Elsulfavirine与Lenvatinib联合协同抑制肿瘤生长。临床上，ADSL磷酸化和INSIG琥珀酰化与人HCC中SREBP-1激活和不良预后相关。总之，这些发现揭示了一种肿瘤细胞通过ADSL的兼职功能协调葡萄糖代谢和脂肪生成的重定位机制，并强调了一种用于肝癌治疗的重定位策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤细胞如何感知葡萄糖并将糖代谢与脂肪生成等生物合成过程协调起来，ADSL是否具有促进蛋白琥珀酰化的兼职功能。
- 核心机制
- 葡萄糖激活PKCε使ADSL S407磷酸化并转位至内质网；ADSL产生的富马酸使INSIG1 C167/INSIG2 C111琥珀酰化，降低INSIG与氧固醇结合，促使SCAP-SREBP复合物转位至高尔基体并激活SREBP-1/2，从而促进脂肪生成。
- 主要证据
- 在Huh7和HCCLM3细胞中通过免疫共沉淀、免疫荧光、体外激酶实验、LC-MS/MS、[3H]25-羟基胆固醇结合实验、SRE荧光素酶报告基因、14C-葡萄糖示踪和BODIPY脂滴染色验证；INSIG1/2 C167S/C111S敲入及ADSL突变体抑制上述过程；小鼠移植瘤和AKT/c-Met转基因模型显示ADSL突变体或INSIG1/2 2C/S抑制肿瘤生长；84例HCC患者IHC显示ADSL pS407和INSIG1/2琥珀酰化与SREBP-1核表达及不良生存相关。
- 研究意义
- 揭示ADSL通过兼职功能协调葡萄糖代谢与脂肪生成的机制，并提出Elsulfavirine与Lenvatinib联合用于肝癌治疗的重定位策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PKCε磷酸化ADSL S407的验证
确定葡萄糖诱导ADSL磷酸化的激酶及关键磷酸化位点。
用PKC抑制剂和PKCε敲低/回补实验验证PKCε的作用；体外激酶实验和质谱鉴定ADSL S407位点；构建S407A/S407D突变体检测其内质网转位和与INSIG1/2的结合。
ADSL代谢活性依赖的SREBP激活和脂肪生成检测
验证ADSL的酶活性是否参与高糖诱导的SREBP激活和脂肪生成。
在ADSL敲低细胞中回补WT、S407A、A291V等突变体，检测SCAP-INSIG解离、SCAP高尔基体转位、SREBP-1切割/核转位/转录活性、下游基因表达、14C-葡萄糖掺入TG/FA及脂滴数量。
INSIG1/2琥珀酰化位点鉴定及功能验证
确定ADSL产生的富马酸是否使INSIG1/2琥珀酰化及其对氧固醇结合的调控。
用LC-MS/MS鉴定INSIG1 C167和INSIG2 C111琥珀酰化位点；用特异性抗体检测高糖、ADSL突变体和DMF处理下的琥珀酰化；用[3H]25-羟基胆固醇结合实验检测琥珀酰化对INSIG与氧固醇结合的影响；用分子动力学模拟分析scC111-INSIG2-SCAP复合物稳定性。
INSIG1/2琥珀酰化对SREBP通路及肿瘤生长的验证
验证INSIG1/2 C167/C111琥珀酰化是否介导高糖诱导的SREBP激活和HCC进展。
在INSIG1 C167S/INSIG2 C111S敲入细胞中检测SCAP-INSIG解离、SREBP-1切割/核转位/转录活性、下游基因表达、14C-葡萄糖掺入脂质和脂滴；用小鼠移植瘤和AKT/c-Met转基因模型检测肿瘤生长。
Elsulfavirine阻断ADSL-INSIG1/2相互作用的验证
筛选并验证可阻断ADSL-INSIG1/2相互作用的小分子抑制剂。
通过药效团和分子对接虚拟筛选FDA批准药物库，选出Tezacaftor、Elsulfavirine和Pyrithioxin；用GST pulldown、免疫共沉淀、分子动力学模拟、靶点结合和热位移实验验证Elsulfavirine与INSIG1/2结合并破坏ADSL-INSIG2复合物；检测其对SREBP-1激活和脂质合成的影响。
Elsulfavirine联合Lenvatinib的体内抗肿瘤效果评估
评估Elsulfavirine单药及联合Lenvatinib对HCC肿瘤生长的抑制作用。
在Huh7皮下移植瘤小鼠中分组给予对照、Lenvatinib、Elsulfavirine或联合处理，检测肿瘤体积、重量、Ki-67、凋亡及SREBP-1和脂质合成酶表达；在Hepa1-6荷瘤模型中进行验证。
临床HCC样本中ADSL-INSIG-SREBP轴标志物的分析
评估ADSL pS407、INSIG1/2琥珀酰化和SREBP-1核表达与HCC临床特征及预后的关系。
对30对HCC及癌旁组织和84例切除HCC肿瘤进行IHC，检测PKCε pS729、ADSL pS407、INSIG1/2 scC167/C111和SREBP-1表达，并与总生存期进行Kaplan-Meier分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹和免疫沉淀 | 抗ADSL兔抗体 | Abcam | ab154872 |
| 抗INSIG1兔抗体 | Abcam | ab70784 | |
| 抗PKCε S729兔抗体 | Abcam | ab63387 | |
| 抗Calnexin兔抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 抗SREBP-1兔抗体 | Abcam | ab28481 | |
| 抗SCAP兔抗体 | Abcam | ab125186 | |
| 抗PKCε抗体 | Cell Signaling Technology | #2683 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | #3724 | |
| 抗PKCα兔抗体 | ABclonal | A0267 | |
| 小鼠抗ADSL抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365623 | |
| 抗SREBP-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13551 | |
| 细胞培养和药物处理 | U0126 | MedChemExpress | -- |
| MK-2206 | MedChemExpress | -- | |
| SU6656 | MedChemExpress | -- | |
| AEB071 | MedChemExpress | -- | |
| Elsulfavirine | MedChemExpress | -- | |
| Tezacaftor | MedChemExpress | -- | |
| 吡硫醇 | MedChemExpress | -- | |
| 仑伐替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 托瑞司他 | MedChemExpress | -- | |
| 普萘洛尔 | MedChemExpress | -- | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MedChemExpress | -- | |
| 体外激酶实验 | ATP-γ-S | Abcam | ab138911 |
| 重组活性PKCε | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫沉淀和pull-down | 抗Flag M2琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| 3×Flag肽 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11008 |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| 脂滴染色 | DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养和转染 | Lipo8000转染试剂 | Beyotime | -- |
| 细胞培养和筛选 | 潮霉素 | EMD Biosciences | 400053 |
| 嘌呤霉素 | EMD Biosciences | 540222 | |
| G418 | EMD Biosciences | 345810 | |
| 内质网分级分离 | 内质网分离试剂盒 | Sigma-Aldrich | ER0100 |
| 富马酸检测 | 富马酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK060 |
| 胆固醇处理 | 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 |
| Diacylglycerol检测 | 二酰甘油检测试剂盒 | Abcam | ab242293 |
| Western blot | 抗硫代磷酸酯抗体 | Abcam | ab92570 |
| 免疫组织化学 | 抗INSIG2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-41707 |
| 免疫荧光 | 抗Golgin97抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-9767-82 |
| 免疫印迹 | 抗PDH E1 Alpha抗体 | Proteintech | 18068-1-AP |
| 抗ACLY抗体 | Proteintech | 15421-1-AP | |
| 免疫印迹和免疫沉淀 | 抗ADSL pS407抗体 | ABclonal Biotechnology | -- |
| 抗INSIG1/2 scC167/C111特异性抗体 | ABclonal Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高糖处理与抑制剂预处理 | 低糖预处理浓度1.25 mM及时间16 h；高糖浓度25 mM；U0126 20 μM、MK-2206 10 μM、SU6656 4 μM、AEB071 5 μM预处理30 min 阅读提示：Methods中Cell culture and transfection小节及Figure 1图注 |
| ADSL突变体回补实验 | ADSL shRNA靶序列及回补的Flag-rADSL WT、S407A、S407D、A291V等突变体；嘌呤霉素和潮霉素筛选浓度 阅读提示：Methods中DNA construction and mutagenesis及Cell culture and transfection小节 |
| INSIG1/2敲入细胞构建 | sgRNA靶序列、ssODN序列及单细胞克隆筛选方法；INSIG1 C167S/INSIG2 C111S敲入验证 阅读提示：Methods中CRISPR-Cas9-mediated genome editing小节及Supplementary Fig. 6a–d |
| [3H]25-羟基胆固醇结合实验 | 纯化His-INSIG1/2用量1.2 μg；[3H]25-羟基胆固醇浓度10–500 nM；4 h室温孵育；n=4生物学重复 阅读提示：Methods中[3H]25-hydroxycholesterol binding assay小节及Figure 3e–h图注 |
| 小鼠移植瘤实验 | Huh7细胞接种数量1×10^6；基质胶比例33%；每组n=6；接种后28天评估；Elsulfavirine和Lenvatinib剂量10 mg/kg每日灌胃20天 阅读提示：Methods中Animal studies小节及Figure 7a,b,g,h图注 |
| AKT/c-Met转基因HCC模型 | 质粒用量：pT3-EF1a-ADSL 20 μg、myr-AKT 20 μg、c-Met 20 μg、SB 2.4 μg； hydrodynamic注射体积2 ml；14周后评估 阅读提示：Methods中Animal studies小节及Supplementary Fig. 11k–m |