基于RFdiffusion的微型蛋白结合剂计算设计
针对C9的膜插入界面设计特异性结合微型蛋白。
以小鼠C9晶体结构（PDB: 6CXO）为模板，选择疏水热点Site-1、Site-2、Site-3及组合Site-1+3，使用RFdiffusion生成支架，ProteinMPNN设计序列，AlphaFold2预测评分，筛选出103个候选微型蛋白。
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靶向补体C9阻断膜攻击复合物组装的微型蛋白抑制剂设计
Design of miniprotein inhibitors targeting complement C9 to block membrane attack complex assembly.
实验完整度
高包含计算设计、体外溶血抑制、BLI/ELISA结合、X射线晶体结构、小鼠体内溶血模型及功能验证。
主要模型
小鼠血清介导的绵羊红细胞溶血模型 人血清介导的溶血模型 C9缺失人血清补体C9重建溶血模型 BALB/c小鼠体内血管内溶血模型
重点核对
体外溶血抑制实验：小鼠血清浓度10%或15%，人血清浓度2%，抑制剂浓度梯度及预孵育条件 结合亲和力检测：BLI使用Fc标记C9蛋白，浓度5 μg/mL，动力学拟合得到Kd值 结合特异性验证：P9/P57与C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9的BLI和ELISA检测 晶体结构验证：P57-M4和P57-M5突变体晶体衍射分辨率1.4 Å和1.8 Å，与设计模型Cα偏差 体内溶血抑制实验：BALB/c小鼠尾静脉注射人血清，抑制剂剂量6 μg/g，不同时间点给药
摘要
膜攻击复合物（MAC）的异常形成与多种急性和慢性免疫疾病密切相关。补体C9插入膜中是MAC形成的最后一步和动力学瓶颈。然而，目前阻断C9形成MAC的研究有限。鉴于C9具有宽大、平坦且极性的功能界面，其理性设计颇具挑战。本研究利用基于深度学习的方法进行蛋白质支架生成、序列设计和复合物结构预测，从头设计特异性阻断可溶性补体C9膜插入的微型蛋白抑制剂。通过部分扩散将微型蛋白抑制剂的结合亲和力进一步优化至700 pM。通过X射线晶体学和生化研究验证了设计准确性和结合特异性。体内急性溶血抑制实验表明，C9微型蛋白抑制剂在补体激活后8分钟仍能有效抑制溶血，优于补体C5抑制剂eculizumab。从头设计的C9微型蛋白抑制剂可为预防和治疗与补体异常激活相关的急慢性免疫疾病提供一种可选的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过从头设计微型蛋白抑制剂特异性阻断补体C9的膜插入，从而抑制膜攻击复合物组装和溶血？
- 核心机制
- 微型蛋白抑制剂特异性结合可溶性补体C9的膜插入界面，阻断C9的膜插入和聚合，从而抑制MAC形成；该抑制严格依赖于C9。
- 主要证据
- 通过体外溶血抑制实验筛选103个候选并优化得到P9和P57，BLI显示P9与 human C9的Kd为0.7 nM；X射线晶体结构验证设计准确性；C9缺失血清重建实验证明抑制依赖C9；ELISA和BLI显示P9/P57特异性结合C9；小鼠体内实验显示抑制剂在补体激活后8分钟仍有效。
- 研究意义
- 从头设计的C9微型蛋白抑制剂可为预防和治疗与补体异常激活相关的急慢性免疫疾病提供一种可选的治疗方法，并在急性溶血中展现出比eculizumab更宽的治疗窗口。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
微型蛋白抑制剂的体外功能筛选
评估设计微型蛋白对补体介导溶血的抑制效果。
将103个微型蛋白在大肠杆菌中表达纯化，用小鼠血清和绵羊红细胞进行溶血抑制实验，初始浓度40 μM，血清浓度10%或15%，筛选出Binder-47进行后续优化。
部分扩散亲和力成熟
提高Binder-47对人C9的结合亲和力和抑制活性。
以AlphaFold3预测的Binder-47与人C9复合物结构为输入，进行部分扩散（diffuser.partial_T 1-25），生成25,000个骨架，经ProteinMPNN和AlphaFold2筛选，选出60个序列合成，通过溶血抑制实验筛选出P9和P57。
晶体结构解析与结合特异性验证
验证设计准确性和抑制剂对C9的结合特异性。
对P57进行表面突变获得P57-M4和P57-M5晶体，解析结构并与设计模型比较；通过C9缺失血清重建实验、BLI和ELISA检测P9/P57与多种补体成分的结合。
体内血管内溶血抑制实验
评估C9微型蛋白抑制剂在体内急性溶血中的效果。
BALB/c小鼠尾静脉注射人血清诱导血管内溶血，比较P9、P57与eculizumab在预孵育和补体激活后不同时间给药的抑制效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | 镍柱树脂 | Qiagen | -- |
| SDS-PAGE | 4–20% SDS-PAGE凝胶 | GenScript | -- |
| 蛋白纯化 | 镍智能磁珠 | Smart-Lifesciences | -- |
| 重组蛋白A/G磁珠 | Smart-Lifesciences | -- | |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 快速蛋白液相色谱系统 | Union-biotech | UEV25D | |
| 溶血抑制实验 | 兔抗绵羊红细胞抗体 | Beijing Bersee Biotechnology | BM351Y |
| 绵羊红细胞 | Zhengzhou Pingrui Biotechnology | ZPRMYHXB-100/4 | |
| 依库珠单抗 | AstraZeneca | -- | |
| C9抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390000 | |
| X197抗体 | Hycultbiotech | HM2111 | |
| C9缺失人血清 | Complement Technology | A326 | |
| 纯化人C9蛋白 | Complement Technology | A126 | |
| ELISA | 人C9蛋白 | Complement Technology | A126 |
| 兔抗His6 HRP偶联抗体 | Proteintech | HRP-84814 | |
| TMB底物 | Thermo Fisher | -- | |
| 补体C3蛋白 | Complement Technology | A113 | |
| 补体C4蛋白 | Complement Technology | A105 | |
| 补体C5蛋白 | Complement Technology | A120 | |
| 补体C6蛋白 | Sino Biological | 12426-H08H | |
| 补体C7蛋白 | Sino Biological | 13848-H08H | |
| 补体C8α蛋白 | Abcam | ab316549 | |
| HRP马来酰亚胺激活标记试剂盒 | TCI Chemicals | -- | |
| BLI | OCTET RED96E系统 | ForteBio | -- |
| Protein A传感器 | ForteBio | -- | |
| SA传感器 | ForteBio | -- | |
| 生物素化试剂盒 | Genemore | -- | |
| CD | Chirascan V100仪器 | Applied Photophysics | -- |
| 晶体筛选 | mosquito LCP | SPT Labtech | -- |
| X射线衍射 | 内置X射线衍射系统 | Rigaku | -- |
| 体内溶血实验 | 游离血红蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外溶血抑制实验 | 血清种属和浓度（小鼠血清10%或15%，人血清2%）、抑制剂浓度梯度、预孵育条件（4°C 45分钟）和反应条件（37°C 30分钟） 阅读提示：Methods中“In vitro hemolysis inhibition assay”小节及图2、3、5的图注 |
| BLI结合亲和力检测 | C9蛋白浓度（5 μg/mL）、传感器类型（Protein A或SA）、加载时间（600秒）、结合解离时间（240秒，Binder-47与人C9为180秒）、拟合模型（1:1） 阅读提示：Methods中“BLI”小节及图2f、3e、3f的图注 |
| 晶体结构解析 | P57突变体设计（P57-M4、P57-M5）、结晶条件（P57-form 1和form 2的沉淀剂和pH）、衍射分辨率（1.4 Å和1.8 Å） 阅读提示：Methods中“Crystallization and structural determination”小节及Supplementary Table 1和2 |
| 体内血管内溶血实验 | 小鼠品系（8周龄雄性BALB/c）、人血清剂量（1.5 μl/g或100 μl/只）、抑制剂剂量（6 μg/g）、给药时间点（预孵育或激活后2-12分钟）、检测终点（血浆游离血红蛋白和414 nm吸光度） 阅读提示：Methods中“In vivo intravascular hemolytic studies”小节及图6图注 |
| C9重建溶血实验 | C9缺失人血清浓度（2%）、补充纯化人C9量（600 ng/孔）、抑制剂浓度 阅读提示：Methods中“In vitro hemolysis inhibition assay”小节及图4c图注 |