鉴定p72宿主结合伴侣
寻找与ASFV p72相互作用的宿主蛋白。
ASFV感染PAMs后，用抗p72抗体进行co-IP，共沉淀物经LC-MS/MS鉴定出猪亲环素A（CypA/PPIA）来源肽段。
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亲环素A稳定衣壳蛋白p72以促进非洲猪瘟病毒复制
Cyclophilin A stabilizes the capsid protein p72 to facilitate African swine fever virus replication.
实验完整度
高包含体外重组蛋白结合、细胞模型、原代PAM感染、BK2258基因敲除、RNA-seq及电镜等多种独立证据层级和功能验证
主要模型
猪肺泡巨噬细胞（PAMs） HEK293T细胞 BK2258野猪肾细胞系 ASFV HLJ/18株及HLJ/18-7GD株感染模型
重点核对
PAMs感染ASFV HLJ/18株的MOI（如5、0.2、0.1、1）及感染时间点（0-96 hpi） CypA抑制剂CsA、NIM811、Alisporivir的使用浓度（5-20 μM）和处理时间（24-72 h） CHX chase实验中CHX浓度（100 μM）及处理时间点 MG132（10 μM, 24 h）、BafA1（200 nM, 24 h）、TAK-243（2 μM, 3 h）的处理条件 siRNA或sgRNA靶向CypA的序列及敲低/敲除效率验证
摘要
非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种大型DNA病毒，对全球养猪业构成重大威胁。其病毒粒子被主要由结构蛋白p72组成的二十面体衣壳所包裹，p72约占病毒粒子总质量的三分之一。尽管p72含量丰富，但调控其稳定性的机制仍知之甚少。本研究发现，宿主介导的p72稳定对于ASFV高效复制至关重要。对p72共沉淀物进行质谱分析，鉴定出宿主亲环素A（CypA，也称为PPIA）是p72的关键结合伴侣。CypA在体外和体内均与p72相互作用，通过其疏水腔特异性结合p72的暴露区域。CypA的相互作用通过减少p72的泛素化并阻止其蛋白酶体降解来稳定p72，而环状CypA抑制剂则通过破坏这种相互作用并促进p72泛素化来使其不稳定。重要的是，对CypA的遗传或药理学抑制显著损害ASFV复制。机制上，CypA抑制通过减少p72蛋白积累而不影响其转录，从而破坏病毒工厂形成和病毒粒子组装。总之，我们的发现揭示了一种宿主依赖的调控衣壳蛋白稳定性的机制，并强调宿主CypA作为抗ASFV抗病毒策略的有希望靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主蛋白如何调控ASFV主要衣壳蛋白p72的稳定性，以及该调控对ASFV复制的影响。
- 核心机制
- 宿主CypA通过其疏水腔结合p72的ER1区域，减少p72的K63连接泛素化，从而抑制蛋白酶体降解，稳定p72蛋白；CypA抑制剂则破坏该相互作用，促进p72泛素化和降解。
- 主要证据
- 质谱鉴定CypA为p72结合伴侣；体外Strep pulldown和细胞内co-IP证实直接相互作用；CypA过表达/敲除及抑制剂处理调节p72蛋白水平和泛素化；CypA抑制减少病毒工厂形成和成熟病毒粒子产生，并抑制ASFV复制。
- 研究意义
- 揭示了宿主依赖的衣壳蛋白稳定性调控机制，并提示宿主CypA可作为抗ASFV抗病毒策略的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CypA与p72的直接相互作用
确认CypA与p72在体外和细胞内结合。
用重组Strep-p72三聚体与GST-CypA进行Strep pulldown，并在HEK293T细胞中共表达Strep-p72和CypA-HA进行co-IP，以及免疫荧光共定位。
解析CypA-p72结合界面
确定CypA与p72结合的结构基础和关键区域。
利用AlphaFold3预测CypA-p72复合物结构，构建CypA截短体和疏水腔8A突变体进行体外结合实验，并用抗p72抗体竞争结合实验验证p72的ER1区域。
验证CypA对p72稳定性的调控
明确CypA是否影响p72蛋白降解和泛素化。
在HEK293T细胞中过表达或敲除CypA，用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂BafA1、UBE1抑制剂TAK-243处理，CHX chase检测p72半衰期，并在变性条件下IP检测p72泛素化及泛素链类型。
评估CypA抑制剂对p72及ASFV感染的影响
检验药理学抑制CypA对p72稳定性和ASFV复制的作用。
用CsA、NIM811、Alisporivir处理p72表达细胞或ASFV感染的PAMs/BK2258细胞，检测p72蛋白水平、泛素化、病毒基因拷贝数、病毒蛋白表达和感染细胞比例。
确定CypA调控的病毒生命周期阶段
明确CypA抑制影响ASFV复制周期的哪个环节。
通过吸附和内化实验、单周期病毒DNA复制和B646L转录检测、病毒工厂免疫荧光和透射电镜观察，评估CypA对病毒进入、基因表达、病毒工厂形成和病毒粒子组装的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与修饰
验证细胞定位与形态
鉴定与预测结合界面
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT |
| 猪血清 | HyClone | SH30908.04 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | Sigma | F8687-500mL | |
| 转染 | Lipo293转染试剂 | Beyotime | C0521 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | 11668019 | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-100 | |
| Western blot | 抗p72兔多克隆抗体 | -- | -- |
| 抗p72鼠单克隆抗体 | -- | -- | |
| 抗p30鼠抗体 | -- | -- | |
| 抗p54抗体 | -- | -- | |
| 抗Flag鼠单克隆抗体 | Biolinkedin | L-MAb03 | |
| 抗HA鼠单克隆抗体 | Biolinkedin | L-MAb01 | |
| 抗GST鼠单克隆抗体 | Biolinkedin | L-MAb04 | |
| 抗Flag兔单克隆抗体 | Sigma | F7425 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma | D9542 |
| Western blot | 抗HA兔抗体 | ABclonal | AE036 |
| 抗β-actin抗体 | GenScript | A00702 | |
| 鼠IgG同型对照 | GenScript | A01007 | |
| 抗CypA单克隆抗体 | Proteintech | 67880-1-Ig | |
| 抗CypA兔多克隆抗体 | Proteintech | 10720-1-AP | |
| 抗LC3兔多克隆抗体 | Proteintech | 14600-1-AP | |
| 抗Strep抗体 | Solarbio | K200012M | |
| 抗泛素兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| K63连接泛素抗体 | Selleck | F0528 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21422 |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21429 | |
| 山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| 免疫沉淀 | 正常兔IgG对照 | Sino Biological | CR1 |
| Western blot | 山羊抗鼠IgG过氧化物酶标记二抗 | Jackson immunoresearch | 115-035-003 |
| 山羊抗兔IgG过氧化物酶标记二抗 | Jackson immunoresearch | 111-035-003 | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin树脂 | Biolinkedin | L2302 |
| 免疫沉淀 | 抗Flag琼脂糖亲和凝胶 | Biolinkedin | L-1109S |
| 抗HA琼脂糖亲和凝胶 | Biolinkedin | L-1107S | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B树脂 | Cytiva | 10250335 |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B树脂 | BBI | C600031-0100 | |
| 免疫沉淀 | PureProteome蛋白A/G磁珠 | Merck-Millipore | LSKMAGAG10 |
| 抑制剂处理 | MG132 | Selleck | S2619 |
| 巴弗洛霉素A1 | MCE | HY-100558 | |
| TAK-243 | MCE | HY-100487 | |
| 环孢素A | MCE | HY-B0579 | |
| Alisporivir | MCE | HY-12559 | |
| NIM811 | MCE | HY-P0025 | |
| 质谱分析 | UltiMate3000快速分离系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF-X轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 病毒DNA提取 | QIAamp DNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | ABI QuantStudio5系统 | Applied Biosystems | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| SYBR Green实时PCR预混液 | TOYOBO | QPK-201 | |
| 透射电镜 | Hitachi H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 免疫荧光 | 荧光封片剂 | Dako Omnis | S3023 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ASFV感染与p72表达动力学 | PAMs感染ASFV HLJ/18株的MOI（5）、感染时间点（0、3、6、12、18、24 hpi）及Western blot检测抗体 阅读提示：Fig. 1A图注及Methods中Cell and viruses和ASFV infection assay小节 |
| CypA-p72相互作用验证 | 重组Strep-p72三聚体与GST-CypA的用量、孵育条件（4°C 4 h或过夜）、竞争实验中CypA抑制剂浓度（5 μM）或抗体用量（10 μg） 阅读提示：Fig. 2A-C、Fig. 3F/H/J、Fig. 5B图注及Methods中Strep pull-down assay小节 |
| p72降解途径与泛素化检测 | MG132（10 μM, 24 h）、BafA1（200 nM, 24 h）、TAK-243（2 μM, 3 h）的处理条件；CHX（100 μM）处理时间点；变性IP条件 阅读提示：Fig. 4A、F、G-I及Methods中Cycloheximide chase assay和In vivo ubiquitination assay小节 |
| CypA抑制剂对ASFV复制的影响 | CsA、NIM811、Alisporivir的使用浓度（5-20 μM）、处理时间（24-72 h）、ASFV毒株（HLJ/18或HLJ/18-7GD）及MOI（0.1-1） 阅读提示：Fig. 5C-E、Fig. 6C-L、Fig. 7图注及Methods中ASFV infection assay小节 |
| 病毒工厂和病毒粒子组装观察 | 感染MOI（5）、抑制剂处理时间、透射电镜固定条件（2.5%戊二醛，4°C过夜）及病毒工厂定量方法 阅读提示：Fig. 8F-J图注及Methods中Immunofluorescence and confocal microscopy和Transmission electron microscopy小节 |