条件性BCL-2转基因小鼠构建与成纤维细胞特异性表达验证
验证人BCL-2可在成纤维细胞中条件性表达并定位于线粒体。
构建CFP/BCL-2stopfl/fl小鼠，与PDGFRα-CreERT2或Col1a1-CreERT2杂交，他莫昔芬诱导后检测BCL-2、CFP表达及细胞类型特异性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
成纤维细胞中条件性BCL-2表达促进持续性肺纤维化，并可通过治疗性BCL-2抑制逆转
Conditional BCL-2 Expression in Fibroblasts Promotes Persistent Pulmonary Fibrosis which is Reversible by Therapeutic BCL-2 Inhibition.
实验完整度
高含条件性转基因小鼠、两种Cre驱动、bulk RNA-seq、空间转录组、人IPF组织及ABT-199体内治疗验证
主要模型
PDGFRα-CreERT2;CFP/BCL-2stopfl/+小鼠 Col1a1-CreERT2;CFP/BCL-2stopfl/+小鼠 博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型 人IPF肺组织及对照肺组织
重点核对
博来霉素气管内滴注剂量1.5 U/kg，溶于无菌生理盐水，体积50 μL 他莫昔芬腹腔注射0.25 mg/g体重，溶于玉米油，从博来霉素后第4天开始，第4–21天共5次注射 ABT-199以100 mg/kg每日口服灌胃28天，从纤维化建立后第5周开始 PDGFRα-CFP/BCL-2+小鼠博来霉素组每时间点n=5， saline组n=4；PDGFRα-CFP/BCL-2-小鼠博来霉素组每时间点n=5， saline组n=4–6 成纤维细胞凋亡检测采用PDGFRα/PDGFRβ/TUNEL共染色，计数10张图像/动物
摘要
特发性肺纤维化（IPF）是一种进展性、致死性肺病，继发于慢性上皮损伤。与损伤诱导的稳态肺修复过程中成纤维细胞发生凋亡和清除不同，IPF患者肺部持续积累抗凋亡、促纤维化、产生细胞外基质的成纤维细胞。本研究表明，通过条件性BCL-2表达阻止PDGFRα+成纤维细胞凋亡，可导致衰老、促纤维化成纤维细胞的出现和持续存在，并伴随持久、病理性纤维化肺重塑。此外，对人IPF肺的空间转录组研究证实，纤维化区域存在衰老、表达BCL-2的α-平滑肌肌动蛋白+肌成纤维细胞。具有转化意义的是，在纤维化小鼠中使用ABT-199选择性抑制BCL-2可重新激活成纤维细胞凋亡通路、减少衰老并促进纤维化消退和肺再生。我们的发现提示，成纤维细胞中持续的BCL-2表达阻止稳态肺修复、驱动持续性纤维化，并且是逆转持续性肺纤维化的治疗相关靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 成纤维细胞抗凋亡和衰老如何导致持续性肺纤维化，以及抑制BCL-2能否逆转已建立的纤维化。
- 核心机制
- 成纤维细胞中持续BCL-2表达阻止其凋亡，使其得以持续存在并获得衰老表型，进而阻止稳态肺修复、驱动持续性纤维化和异常上皮重塑；ABT-199抑制BCL-2可重新激活线粒体凋亡通路，清除衰老抗凋亡成纤维细胞。
- 主要证据
- 条件性BCL-2表达小鼠在博来霉素后显示成纤维细胞TUNEL+减少、PDGFRα+成纤维细胞和PDGFRβ+周细胞持续增多、羟脯氨酸持续升高及囊肿形成；bulk RNA-seq和免疫染色显示衰老标志物p16INK、p21WAF、SA-β-gal升高；人IPF肺空间转录组和免疫染色显示BCL-2+αSMA+肌成纤维细胞与衰老基因共定位；ABT-199治疗减少PDGFRα+成纤维细胞、降低羟脯氨酸、改善动脉氧饱和度和肺结构。
- 研究意义
- 提示成纤维细胞中持续的BCL-2表达是阻止稳态肺修复和驱动持续性肺纤维化的机制，BCL-2抑制是逆转持续性肺纤维化的治疗相关靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证BCL-2对成纤维细胞凋亡的抑制作用
检测BCL-2表达是否使成纤维细胞抵抗线粒体和死亡受体途径诱导的凋亡。
原代肺成纤维细胞分别用staurosporine或Jo2联合TNF-α/IFNγ处理，检测caspase-3/7活性。
体内验证BCL-2阻止博来霉素诱导的成纤维细胞凋亡
检测条件性BCL-2表达是否减少纤维化肺中成纤维细胞凋亡。
博来霉素或生理盐水滴注PDGFRα-CFP/BCL-2fl/+小鼠，他莫昔芬或玉米油处理，3周时PDGFRα/PDGFRβ/TUNEL共染色。
评估BCL-2表达对成纤维细胞持续存在和纤维化消退的影响
确定BCL-2驱动的成纤维细胞持续存在是否阻止肺修复并导致持续性纤维化。
博来霉素滴注后0–12周定量PDGFRα+成纤维细胞、PDGFRα+/β+成纤维细胞和PDGFRβ+周细胞，检测羟脯氨酸、Masson三色染色、CCSP/KRT8和pro-SPC染色。
转录组分析成纤维细胞促纤维化和衰老编程
检测BCL-2表达成纤维细胞是否获得持续促纤维化和衰老相关转录程序。
分选 naïve、博来霉素后3周和6周的肺成纤维细胞进行bulk RNA-seq，GO富集分析和衰老基因评分。
验证衰老表型及人IPF肺中的临床相关性
检测BCL-2表达成纤维细胞是否表达衰老标志物，并在人IPF肺中验证。
免疫染色p16INK、p21WAF、SA-β-gal与BCL-2/PDGFRα/PDGFRβ；对人IPF和对照肺进行空间转录组及免疫染色。
在其他持续性纤维化模型中验证衰老与Bcl-2的关联
确定衰老表型是否也出现在其他持续性纤维化模型中。
分析重复博来霉素滴注后24周和Col1a1-CreERT2;Fas−/−小鼠博来霉素后6周的成纤维细胞bulk RNA-seq及免疫染色。
治疗性BCL-2抑制逆转持续性纤维化
检测ABT-199能否清除衰老抗凋亡成纤维细胞并逆转已建立的纤维化。
博来霉素滴注PDGFRα-CFP/BCL-2+小鼠，5周后给予ABT-199或vehicle口服灌胃4周，检测成纤维细胞数量、羟脯氨酸、micro-CT、动脉氧饱和度和衰老标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | -- |
| 他莫昔芬溶剂对照 | 玉米油 | Sigma Aldrich | -- |
| 标准饲料 | 2919饲料 | Inotiv | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 线粒体染色 | 线粒体红色荧光探针 | Invitrogen/ThermoFisher | M7512 |
| 肌动蛋白染色 | 鬼笔环肽（AF488） | Invitrogen/ThermoFisher | #A12379 |
| Western blot | 抗BCL-2抗体 | Abcam | #59348 |
| 抗GFP抗体 | AvesLab | #GFP-1020 | |
| 抗β-actin抗体 | Millipore | #MAB150 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | #8245 | |
| 抗Tom70抗体 | Cell Signaling | #65675 | |
| 细胞处理 | 肿瘤坏死因子α | -- | -- |
| 干扰素γ | -- | -- | |
| Jo2抗Fas抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| 星形孢菌素 | Sigma Aldrich | -- | |
| Caspase活性检测 | Caspase-Glo试剂盒 | Promega | -- |
| 肺纤维化诱导 | 博来霉素 | Amneal Biosciences | -- |
| ABT-199治疗 | ABT-199 | -- | -- |
| ABT-199溶剂 | Phosal 50 PG | -- | -- |
| 聚乙二醇400 | -- | -- | |
| 乙醇 | -- | -- | |
| 组织消化 | 胶原酶 | Sigma Aldrich | C2139 |
| 弹性蛋白酶 | Worthington | LS002274 | |
| 中性蛋白酶 | Worthington | LS02104 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher | 2520056 | |
| DNase I | Worthington | LS006331 | |
| 流式细胞术 | 抗CD45抗体 | -- | 17-0451-82 |
| 抗CD326/EpCAM抗体 | -- | 17-5791-80 | |
| 抗CD31抗体 | BD Biosciences | 541814 | |
| 抗PDGFRα/CD140a抗体 | -- | 25-1401-82 | |
| 抗PDGFRβ/CD140b抗体 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫荧光染色 | M.O.M免疫检测封闭试剂盒 | Vector Laboratories | #BMK-2202 |
| 抗BCL-2抗体（鼠） | BioRad | #MCA1550 | |
| 抗Bcl-2抗体（兔） | Cell Signaling Technology | #3498 | |
| 抗PDGFRα抗体 | Cell Signaling | #3174S | |
| 抗PDGFRβ抗体 | R&D Systems | #AF1032 | |
| 抗αSMA抗体 | Sigma Aldrich | #2547 | |
| 抗p16INK抗体 | Abcam | #ab211542 | |
| 抗p21WAF抗体 | Abcam | #ab188224 | |
| 抗β-半乳糖苷酶抗体 | Cell Signaling | #27198 | |
| 抗CCSP抗体 | Seven Hills Bioreagents | #WRAB-3950 | |
| 抗pro-SPC抗体 | Millipore | #AB3786 | |
| 抗Krt8抗体 | DSHB | #AB531826 | |
| 抗CD45抗体（大鼠） | Invitrogen | 17-0451-82 | |
| 抗CD31抗体（大鼠） | Invitrogen | #14-0311-82 | |
| 山羊抗小鼠-A647二抗 | Invitrogen | A21236 | |
| 驴抗兔-A555二抗 | Invitrogen | A31572 | |
| 山羊抗大鼠-A555二抗 | Invitrogen | A21434 | |
| 驴抗山羊-A647二抗 | Invitrogen | A21447 | |
| TUNEL检测 | TUNEL检测试剂盒 | Promega | -- |
| 封片 | 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| 细胞分选富集 | CD45磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-052-301 |
| CD31磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| CD326磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-105-958 | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 空间转录组 | Nanostring CosMx数字空间分析仪 | Nanostring | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 博来霉素诱导肺纤维化 | 博来霉素剂量1.5 U/kg、体积50 μL、气管内滴注；小鼠8–10周龄 阅读提示：Methods 'Assessment of fibrotic lung disease' |
| 他莫昔芬诱导Cre重组 | 他莫昔芬0.25 mg/g体重腹腔注射，从博来霉素后第4天开始，第4–21天共5次注射；对照为玉米油 阅读提示：Methods 'Mice' |
| ABT-199治疗 | ABT-199 100 mg/kg每日口服灌胃28天，从博来霉素后第5周开始；vehicle组成 阅读提示：Methods 'Assessment of fibrotic lung disease' |
| 成纤维细胞凋亡检测 | PDGFRα/PDGFRβ/TUNEL共染色，计数10张图像/动物，排除气道上皮TUNEL+细胞 阅读提示：Methods 'Immunofluorescent staining' |
| bulk RNA-seq | 每组n=4生物学重复；分选Lin-活细胞至少300,000个；DESeq2分析FDR≤0.05 阅读提示：Methods 'Bulk RNA sequencing'及图5、6图注 |
| 空间转录组 | n=13对照、n=15 IPF；使用Nanostring CosMx；衰老模块10基因 阅读提示：Methods 'Spatial transcriptomic analysis'及图6图注 |