全基因组CRISPRi筛选鉴定差异修复因子
筛选决定Cas9平末端和Cas12a交错末端DSB修复差异的细胞因子
在K-562 CRISPRi细胞中转导Weissman v266 gRNA文库，分别电转Cas9 RNP、Cas12a RNP或mock对照，培养两周后测序gRNA cassette
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ERCC6L2确保交错末端DNA双链断裂的修复保真性
ERCC6L2 ensures repair fidelity for staggered-end DNA double-strand breaks.
实验完整度
高全基因组CRISPRi筛选、多种细胞模型（K-562、RPE1、患者BMSC）、体内外功能验证及生化重构
主要模型
人K-562细胞系 人RPE1 TP53−/−细胞系（含ERCC6L2−/−、K154R等突变克隆） 患者来源的骨髓基质细胞（BMSCs） 重组人ERCC6L2蛋白及DNA底物体外生化体系
重点核对
CRISPRi筛选：K-562 dCas9-BFP-KOX1细胞，Weissman v266文库，MOI 0.3，Cas9/Cas12a RNP电转 编辑结果检测：TRAC、CCR5、AAVS1位点，短读长Illumina和长读长Nanopore测序，n=1-3生物学重复 ERCC6L2敲除克隆：RPE1 TP53−/−背景，克隆47和69.2，TIDE分析验证 患者BMSC：ERCC6L2纯合突变（c.2101C>T, p.Gln701X），Cas9/Cas12a RNP编辑 生化实验：EMSAs和DNA解链实验，ERCC6L2蛋白浓度递增，ATP/AMP-PNP/EDTA条件
摘要
DNA双链断裂（DSB）既威胁基因组完整性，也常用于基因组编辑应用。DSB末端的结构特征在决定DNA修复途径使用和基因组编辑结果中起关键作用，但参与这些过程的细胞因子仅部分已知。通过全基因组CRISPRi筛选，我们发现ERCC6L2对修复Cas12a诱导的交错DSB至关重要，但与Cas9诱导的平末端DSB无关。我们表明ERCC6L2作为具有5′或3′极性的交错DSB的保护因子，防止由Cas12a、TALEN或双Cas9切口诱导的DNA损伤引起的大片段缺失和易位。此外，ERCC6L2缺失使细胞对由混杂Cas12a活性或依托泊苷诱导的TOP2捕获产生的多个交错DSB超敏。通过结合遗传学和生化重构，我们发现ERCC6L2通过结合并解链交错DNA末端来对抗MRE11-RAD50-NBS1（MRN）介导的切除，从而促进准确的末端连接。我们的数据揭示了ERCC6L2在交错末端DSB修复中的保护作用，这提示了ERCC6L2突变患者病理的分子基础，并警告不要使用产生悬垂末端的基因组编辑工具进行治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ERCC6L2在平末端和交错末端DNA双链断裂修复中的差异作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- ERCC6L2通过结合并解链交错DNA末端（5′或3′悬垂），对抗ATM诱导的MRN复合物介导的末端切除，从而促进准确的NHEJ修复。
- 主要证据
- 全基因组CRISPRi筛选鉴定ERCC6L2对Cas12a交错DSB修复关键；ERCC6L2缺失导致大片段缺失、易位和细胞毒性；生化实验显示重组ERCC6L2解链交错末端DNA；ATMi和MRE11i rescue实验证实ATM-MRN通路。
- 研究意义
- 揭示了ERCC6L2突变患者病理的分子基础，并提示应避免使用产生交错DSB的基因组编辑工具治疗ERCC6L2突变患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ERCC6L2在交错DSB修复中的选择性作用
确认ERCC6L2缺失对Cas9和Cas12a DSB修复结果的影响
在RPE1 TP53−/− ERCC6L2−/−克隆和患者BMSC中，用Cas9或Cas12a RNP靶向TRAC、CCR5、AAVS1位点，短读长和长读长测序分析 indel 谱
检测大片段缺失、易位和染色体臂丢失
评估ERCC6L2缺失对基因组稳定性的影响
使用CAST-seq检测易位，GFP报告系统检测>1 Mb缺失和染色体臂丢失，双切口酶产生5′或3′悬垂
评估细胞毒性和内源性交错DSB敏感性
测试ERCC6L2缺失对多交错DSB和依托泊苷诱导TOP2损伤的敏感性
使用gMulti产生多个Cas12a DSB，竞争实验、克隆形成实验、 Annexin V凋亡检测、微核检测；依托泊苷处理及克隆形成
解析ERCC6L2与ATM-MRN切除通路的关系
确定ERCC6L2是否对抗ATM-MRN介导的末端切除
ATMi（AZD0156）处理、ATM−/−细胞、MRE11i（PFM03）、NBN−/−细胞、RPA foci检测、SMART assay、DIVA assay
生化重构ERCC6L2的DNA结合和解链活性
确定ERCC6L2对交错末端DNA的直接生化作用
从Sf9细胞纯化重组ERCC6L2，EMSAs检测DNA结合，解链实验检测SSB存在下对5′/3′悬垂、平末端和Y结构的解链
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RPMI-1640 GlutaMAX培养基 | -- | -- | |
| αMEM培养基 | Thermo Fisher | 32571093 | |
| 间充质干细胞专用胎牛血清 | Thermo Fisher | 12662029 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | -- | |
| 电转 | 4D核转染仪 | Lonza | -- |
| 核转染液 | Lonza | -- | |
| CRISPRi筛选 | Weissman v266全基因组gRNA文库 | -- | -- |
| Puregene基因组DNA纯化试剂盒 | Gentra | -- | |
| NEBNext Ultra II Q5高保真聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| NextSeq 2000 P3测序芯片 | Illumina | -- | |
| 流式分析 | Attune NxT流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | RNeasy RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | -- | |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Illumina测序 | QuickExtract DNA提取液 | Lucigen | -- |
| DNeasy DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| MiSeq 2×150双端测序芯片 | Illumina | -- | |
| Nanopore测序 | 连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore | SQK-LSK114 |
| PromethION测序仪及R10.4.1芯片 | Oxford Nanopore | -- | |
| 细胞系构建 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| MoFlo Astrios流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 细胞增殖 | IncuCyte S3活细胞分析系统 | Sartorius | -- |
| ddPCR | QX200微滴生成仪 | Bio-Rad | -- |
| QX200微滴读取仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma Aldrich | F1804 |
| 抗ERCC6L2抗体 | Sigma Aldrich | HPA022422 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 97166 | |
| 抗MRE11抗体 | Novus Biologicals | NB100-142 | |
| 抗NBS1抗体 | GeneTex | GTX70224 | |
| 抗CtIP抗体 | Thermo Fisher | 61141 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| CAST-seq | NEBNext Ultra II FS DNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| DISCOVER-seq | MRE11抗体 | Novus Biologicals | NBP3-25349 |
| 蛋白A Dynabeads磁珠 | Invitrogen | -- | |
| MinElute纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Covaris S2超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂 | Biolegend | -- |
| DAPI溶液 | BD Bioscience | -- | |
| PLA | Duolink原位PLA抗小鼠/抗兔探针 | Sigma-Aldrich | -- |
| Duolink原位检测试剂FarRed试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PLA/免疫荧光 | Opera Phenix高内涵成像系统 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗RPA32抗体 | Abcam | ab2175 |
| 抗磷酸化H2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 2577 | |
| 抗BrdU抗体 | Cytiva | RPN20AB | |
| SMART | 小鼠抗BrdU抗体 | BD Biosciences | clone B44 |
| Alexa Fluor 488标记抗小鼠二抗 | -- | -- | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | 镍-NTA树脂 | Thermo Scientific | -- |
| 16/60 Sephacryl S-300 HR凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| 直链淀粉树脂 | New England Biolabs | -- | |
| PreScission蛋白酶 | -- | -- | |
| 镍-NTA琼脂糖树脂 | Qiagen | -- | |
| 生化实验 | AMP-PNP（腺苷酰亚胺二磷酸） | -- | -- |
| 人RPA蛋白 | -- | -- | |
| 抑制剂处理 | AZD7648 DNA-PKcs抑制剂 | -- | -- |
| PolQi2 Polθ抑制剂 | -- | -- | |
| AZD0156 ATM抑制剂 | -- | -- | |
| PFM03 MRE11抑制剂 | -- | -- | |
| 药物处理 | 依托泊苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPRi筛选 | 细胞系（K-562 dCas9-BFP-KOX1）、文库（Weissman v266）、MOI（0.3）、RNP用量（100 pmol/1×10^6细胞）、培养时间（13天） 阅读提示：Methods 'Cas9/Cas12a CRISPRi screen' |
| Cas9/Cas12a编辑 | RNP比例（Cas9/Cas12a 100 pmol + gRNA 120 pmol）、电转程序（K-562 SF/FF-120；RPE1 P3/EA-104；BMSC P3/FF-104）、收获时间（72小时，BMSC 120小时） 阅读提示：Methods 'Cas9 and Cas12a genome editing' |
| ERCC6L2敲除细胞系 | 细胞背景（RPE1 TP53−/−）、克隆编号（47和69.2）、验证方法（TIDE分析） 阅读提示：Methods 'Cell line generation' |
| 患者BMSC编辑 | 患者基因型（ERCC6L2 NM_020207.4:c.2101C>T, NP_064592.2:p.Gln701X）、细胞来源（骨髓基质细胞） 阅读提示：Results 'ERCC6L2 prevents large deletions...' 及 Methods 'Cell culture' |
| 生化解链实验 | 缓冲液组成（25 mM Tris acetate pH 7.5, 20 mM NaCl, 2 mM magnesium acetate, 1 mM DTT）、ATP/AMP-PNP浓度（1 mM）、RPA浓度（15 nM）、反应温度和时间（37°C, 30分钟） 阅读提示：Methods 'Helicase assay' |