小分子化合物筛选鉴定协同致死化合物
寻找可增强PARPi在BRCA功能正常卵巢癌细胞中杀伤作用的化合物。
在ES-2细胞中联合olaparib与144种细胞死亡相关化合物进行两轮筛选，并对候选化合物进行低浓度验证。
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靶向从头嘧啶合成使PARP抑制剂耐药的卵巢癌对铜介导的ATR失活产生脆弱性
Targeting de novo pyrimidine synthesis confers vulnerability to copper-mediated ATR inactivation in PARP inhibitor-resistant ovarian cancer.
实验完整度
高含小分子筛选、多种卵巢癌细胞系体外功能验证、机制验证（Co-IP、PLA、金属pull-down）以及异种移植、PDO和PDX体内验证，具备多层级独立证据和功能/机制验证。
主要模型
BRCA功能正常透明细胞卵巢癌细胞系ES-2 BRCA功能正常黏液性卵巢癌细胞系3AO ES-2和3AO细胞来源皮下异种移植瘤模型 BRCA1/2野生型卵巢癌患者来源类器官(PDO) 八例卵巢癌患者来源异种移植(PDX)模型
重点核对
ES-2细胞以olaparib（10 μM和50 μM）联合144种细胞死亡相关化合物筛选，初筛浓度50 μM和10 μM，复筛1 μM和500 nM，48 h后CCK-8检测 elesclomol-copper与olaparib联合的Bliss协同评分：ES-2中olaparib 50–100 μM联合elesclomol-copper 160–240 nM；3AO中olaparib 100–150 μM联合elesclomol-copper 160–320 nM，处理48 h ES-2和3AO异种移植瘤模型：olaparib 50 mg/kg，elesclomol-copper 5 mg/kg，每组n=8（肿瘤生长/瘤重），γ-H2AX IHC n=5 药物适应性细胞建立：ES-2细胞用elesclomol-copper（200 nM）和olaparib（100 μM）单独或联合处理7天 Co-IP和PLA检测ATR-ATRIP相互作用：olaparib 20 μM预处理12 h，再以elesclomol-copper处理12 h
摘要
尽管聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(PARPi)作为单药或与其他DNA损伤剂联合显示出有希望的临床疗效，但治疗反应通常是短暂的，随后出现的获得性耐药构成重大挑战。在此，通过小分子化合物筛选，我们鉴定出elesclomol，一种有效的铜离子载体，它通过抑制ATR-CHK1通路的激活使BRCA功能正常的卵巢癌细胞对PARPi敏感。机制上，我们证明铜直接结合ATRIP，ATR激活的关键辅因子，破坏ATR-ATRIP相互作用，进一步损害ATR介导的DNA损伤修复信号并增强PARPi敏感性。重要的是，我们揭示了PARPi耐药卵巢癌中与从头嘧啶合成相关的继发性代谢脆弱性，提示靶向该通路是在ATR和PARP共同抑制后根除药物适应性残留肿瘤和耐药患者来源异种移植模型的有效策略。这些发现提出从头嘧啶合成是一种适应性代谢脆弱性，可作为治疗靶点克服BRCA功能正常卵巢癌中的PARPi耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何克服BRCA功能正常卵巢癌对PARP抑制剂的耐药，并明确PARPi耐药细胞中可靶向的代谢脆弱性。
- 核心机制
- 铜直接结合ATRIP，破坏ATR-ATRIP相互作用，抑制ATR-CHK1介导的DNA损伤修复信号，使BRCA功能正常卵巢癌细胞对PARPi敏感；PARPi耐药细胞激活从头嘧啶合成，靶向该通路可增强ATR和PARP共同抑制的疗效。
- 主要证据
- 小分子化合物筛选鉴定elesclomol；ES-2和3AO细胞中elesclomol-copper与olaparib协同致死并增加γ-H2AX；金属pull-down、Co-IP和PLA证明铜结合ATRIP并破坏ATR-ATRIP相互作用；代谢组学和15N-谷氨酰胺示踪显示药物适应性细胞从头嘧啶合成增强；PDO和PDX模型验证联合DHODH抑制的疗效。
- 研究意义
- 提出从头嘧啶合成作为PARPi耐药卵巢癌的适应性代谢脆弱性，为BRCA功能正常卵巢癌中PARPi耐药提供潜在治疗策略，并提示基于嘧啶依赖性的选择性治疗思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证elesclomol-copper与PARPi的协同作用
验证elesclomol-copper是否增强卵巢癌细胞对PARPi的敏感性。
在多种BRCA功能正常卵巢癌细胞系中测定elesclomol-copper和PARPi的IC50，并进行Bliss协同分析。
体内验证elesclomol-copper与olaparib联合的抗肿瘤效果
评估联合治疗在BRCA功能正常卵巢癌异种移植瘤模型中的疗效。
建立ES-2和3AO皮下异种移植瘤模型，给予vehicle、olaparib、elesclomol-copper或联合治疗，监测肿瘤生长、瘤重和γ-H2AX表达。
建立药物适应性耐药细胞并分析ATR-CHK1通路激活
明确PARPi耐药细胞是否优先激活ATR-CHK1通路。
用高剂量elesclomol-copper或olaparib持续处理ES-2细胞7天获得药物适应性存活细胞，检测药物反应、增殖、细胞周期，并通过RNA-seq、Western blot和IF分析ATR-CHK1与ATM-CHK2通路。
验证铜结合ATRIP并破坏ATR-ATRIP相互作用
阐明铜抑制ATR-CHK1通路的分子机制。
利用AlphaFold3预测铜与ATR/ATRIP的结合，金属负载树脂pull-down检测铜与ATR/ATRIP的结合，Co-IP和PLA检测ATR-ATRIP相互作用。
代谢组学和代谢流分析揭示从头嘧啶合成激活
鉴定PARPi耐药细胞的代谢适应。
对亲本和药物适应性ES-2细胞进行非靶向代谢组学，并用15N-谷氨酰胺示踪分析从头嘧啶合成通量。
验证靶向从头嘧啶合成可逆转耐药
评估抑制从头嘧啶合成是否能增强PARP和ATR共同抑制的疗效。
用尿苷、胞嘧啶或胸苷预处理细胞，再用olaparib联合elesclomol-copper或AZD6738处理；用DHODH抑制剂BAY-2402234联合处理药物适应性细胞和HGSOC细胞系；在PDO模型中测试尿苷补充对疗效的影响。
体内验证ATR和PARP共同抑制后残留肿瘤的嘧啶依赖性
确认残留肿瘤在ATR和PARP共同抑制后是否依赖嘧啶代谢。
建立ES-2异种移植瘤模型，给予olaparib、AZD6738或联合治疗，在指定时间点收集肿瘤进行靶向代谢组学分析。
PDX模型评估选择性治疗策略
在患者来源模型中验证基于嘧啶依赖性的分层治疗策略。
建立八例卵巢癌PDX模型，先给予olaparib单药，再在耐药模型中使用elesclomol+olaparib或AZD6738+olaparib，最后在双耐药模型中使用DHODH抑制剂联合方案。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估细胞活力与药物协同
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与支原体检测 | MycoBlue支原体检测试剂盒 | Vazyme Biotech | D201 |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | Dojindo Laboratories | CK04 |
| 流式细胞术细胞周期分析 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Scientific | C10632 |
| FxCycle Violet染料 | Thermo Scientific | F10347 | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | -- |
| 代谢组学 | 1290 Infinity液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| TripleTOF 6600四极杆飞行时间质谱仪 | AB Sciex | -- | |
| 代谢流分析 | 15N-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-557 |
| FreeZone 6升冻干机 | Labconco | -- | |
| Q Exactive Plus混合四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | 抗p-ATR (S428)抗体 | Cell Signaling Technology | 2853 |
| 抗ATR抗体 | Cell Signaling Technology | 13934 | |
| 抗p-CHK1 (S345)抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| 抗CHK1抗体 | Abcam | ab40866 | |
| 抗ATRIP抗体 | Cell Signaling Technology | 2737 | |
| 抗p-ATM (S1981)抗体 | Cell Signaling Technology | 13050 | |
| 抗ATM抗体 | Cell Signaling Technology | 2873 | |
| 抗p-CHK2 (T68)抗体 | Cell Signaling Technology | 2197 | |
| 抗CHK2抗体 | Cell Signaling Technology | 6334 | |
| Western blot/IHC/IF | 抗γ-H2AX抗体 | ABclonal | AP0687 |
| Western blot | 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 |
| IF | 抗p-ATR (S428)抗体 | ABclonal | AP0676 |
| 抗ATR抗体 | Abcam | ab313435 | |
| 抗p-CHK1 (S345)抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| 抗CHK1抗体 | Abcam | ab40866 | |
| IF/IHC | 抗γ-H2AX抗体 | ABclonal | AP0687 |
| IF二抗 | Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4412 |
| Alexa Fluor 594标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 8889 | |
| IF核染色 | Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 |
| PLA | Duolink原位红色起始试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 抗ATR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515173 | |
| 抗ATRIP抗体 | ABclonal | A5041 | |
| 药物处理 | elesclomol | MedChemExpress | HY-12040 |
| SBE-β-CD | MedChemExpress | HY-17031 | |
| 四硫代钼酸盐 | MedChemExpress | HY-128530 | |
| 奥拉帕利 | MedChemExpress | HY-10162 | |
| 氟唑帕利 | MedChemExpress | HY-114778 | |
| BAY-2402234 | MedChemExpress | HY-112645 | |
| AZD6738 | MedChemExpress | HY-19323 | |
| 尿苷 | MedChemExpress | HY-B1449 | |
| 胞嘧啶 | MedChemExpress | HY-I0626 | |
| 胸苷 | MedChemExpress | HY-N1150 | |
| 金属离子处理 | 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | CWBIO | CW2333 |
| 蛋白酶抑制剂鸡尾酒片 | Roche | 04693132001 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| 金属pull-down | Profinity IMAC树脂 | Bio-Rad | 1560121 |
| IF细胞培养 | μ-Slide V1 0.4腔室载玻片 | ibidi | 80606 |
| 质粒转染 | psPAX2质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| pSIH1-puro载体 | Addgene | 26597 | |
| LentiCRISPR v.2载体 | Addgene | 52961 | |
| Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | 40802 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sangon Biotech | A610593 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小分子化合物筛选 | 细胞系ES-2；olaparib浓度10 μM和50 μM；144种化合物初筛浓度50 μM和10 μM，复筛浓度1 μM和500 nM；处理24 h后CCK-8检测；每组重复数需核对 阅读提示：Methods中Drug screening and cell viability assay小节及Fig. 1a图注 |
| elesclomol-copper与olaparib协同验证 | ES-2和3AO细胞；olaparib与elesclomol-copper的具体浓度范围；处理48 h；Bliss协同评分方法 阅读提示：Fig. 1d、e图注及Results中对应段落 |
| ES-2和3AO异种移植瘤实验 | 小鼠品系BALB/c nude、六周龄雌性；接种细胞数ES-2 2×10^6、3AO 5×10^6；olaparib 50 mg/kg；elesclomol-copper 5 mg/kg；给药途径和持续时间需核对图注；样本量n=8（γ-H2AX IHC n=5） 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 1f–k图注 |
| 药物适应性耐药细胞建立 | ES-2细胞；elesclomol-copper 200 nM和olaparib 100 μM单独或联合处理7天；耐药细胞后续药物反应检测时间48 h 阅读提示：Fig. 2a图注及Results中对应段落 |
| ATR-ATRIP相互作用检测 | Co-IP：olaparib 20 μM预处理12 h，elesclomol-copper处理12 h及浓度；PLA：olaparib 20 μM联合elesclomol-copper 20 nM或50 nM处理12 h；抗体货号 阅读提示：Fig. 3f–h图注及Methods中Co-immunoprecipitation和Proximity ligation assay小节 |
| 15N-谷氨酰胺代谢流分析 | 15N-谷氨酰胺浓度3 mM；37°C处理4 h；每组重复数n=4；LC-MS平台 阅读提示：Fig. 4e图注及Methods中Metabolic flux analysis using 15N-glutamine tracing小节 |
| PDO药物敏感性实验 | PDO来源为BRCA1/2野生型卵巢癌患者；olaparib浓度0、4.94、14.81、44.44、133.33、400 μM；elesclomol-copper 20 nM或AZD6738 40 μM；尿苷100 μM；处理5天；ATP活性检测；每组n=3 阅读提示：Fig. 4g、h图注及Methods中PDO model小节 |
| PDX模型治疗实验 | 八例PDX模型来源和分型；NPI小鼠六周龄雌性；elesclomol 10 mg/kg；olaparib和AZD6738剂量需核对Supplementary Fig. 9a；每组n=5；给药持续时间和途径需核对补充图 阅读提示：Fig. 6a–d图注、Methods中Animal experiments小节及Supplementary Fig. 9a |